不同產地枸杞中主要類胡蘿卜素的聚類分析

曲云卿 張同剛 劉敦華

(寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021)

枸杞又名枸杞子、杞子、枸牙子，是茄科茄亞科枸杞族枸杞屬植物。中國主要分布在寧夏、新疆、甘肅、青海、內蒙古等地，其中寧夏枸杞最著名［1］。枸杞作為藥食同源植物［2］，已被廣泛用在食品工業中。目前中國市場上已開發出枸杞酒、枸杞飲料、枸杞保健品等產品［3，4］。

不同產地的枸杞的品質差異很大。其理化成分、營養成分和生理活性成分的含量存在差異［5］，其價格也有較大差異。但有一些商家為了追求更高的利潤，將不同產地枸杞進行混摻、摻假，嚴重損害了消費者的利益。因此，有必要對不同產地的枸杞的有效成分進行比較和分析。

類胡蘿卜素是枸杞中的主要色素，也是枸杞中的重要活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤等作用。枸杞果實中含有β-胡蘿卜素、玉米黃素和多種類胡蘿卜素酯，其中玉米黃素雙棕櫚酸酯是枸杞中含量最高的類胡蘿卜素［6］。β-胡蘿卜素具有維生素A的活性，玉米黃素具有多種生理功能，如抗氧化、清除自由基、保護視力等［7，8］。目前，對于枸杞中類胡蘿卜素的研究主要集中在類胡蘿卜素的提取方法優化［9］，不同成熟期枸杞類胡蘿卜素的變化上［6］，因此本研究將對不同產地的枸杞中類胡蘿卜素的比較分析作為研究內容。

本研究擬采用分光光度法和高效液相色譜法測定新疆、甘肅、南梁、中寧、惠農、內蒙、固原、青海8個不同產地的枸杞干果中的類胡蘿卜素總量、β-胡蘿卜素、玉米黃素和玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量，并進行聚類分析。旨為今后區分不同產地枸杞，提高枸杞質量提供一些技術參考，同時對指導枸杞種植以及建立枸杞質量標準有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

枸杞:2014年分別從新疆精河、甘肅白銀、南梁、中寧、惠農、內蒙烏拉特前旗先鋒鎮、固原、青海柴達木8個產地取得枸杞干果作為樣品。在當地種植園采摘，每個產地隨機取500 g樣品，烘干，裝入自封袋備用。

丙酮、石油醚:分析純，天津市大茂化學試劑廠;

無水硫酸鈉:分析純，煙臺市雙雙化工有限公司;

甲醇、正己烷、二氯甲烷:色譜純，天津市大茂化學試劑廠;

乙腈:色譜純，天津市光復精細化工研究所。

1.1.2 主要儀器設備

電熱鼓風恒溫干燥箱:101-3型，上海東星建材試驗設備有限公司;

高效液相色譜儀:AGILENT 1100型，配有自動進樣器，安捷倫公司;

色譜柱:ZORBAX Edipse XDB-C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，安捷倫公司;

集熱式恒溫磁力攪拌器:DF-101S型，鞏義市予華儀器有限責任公司;

旋轉蒸發器:RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠;

離心機:Cence-L550型，湘儀離心機儀器有限公司;

循環水式多用真空泵:SHB-Ⅲ型，鄭州長城科工貿有限公司;

電子天平:AL204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;

紫外可見分光光度計:T6新世紀型，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 枸杞樣品前處理 將不同產地的枸杞放入烘箱中，于40℃下，干燥至恒重。

精確稱取約2 g枸杞放入研缽中，加入少量的蒸餾水，研磨成糊狀。倒入離心管中，用蒸餾水將研缽沖洗干凈，洗液合并到離心管中。于3 000 r/min離心3 min，棄去上清液(若上清液表面漂浮著枸杞籽，將種子取出重新研磨)。加入10 mL丙酮，于3 000 r/min離心3 min，將上清液倒入分液漏斗。殘渣中加入適量抗氧化劑(0.01%BHT)，于35℃下，以丙酮和石油醚(1∶2)混合試劑作為提取溶劑，對殘渣進行4次提取，每次提取15 min，提取至無色。合并提取液，倒入分液漏斗。加入少量的蒸餾水，洗去水溶性雜質，棄去水層。加入適量的無水硫酸鈉干燥。將有機層于38℃條件下進行旋轉真空濃縮至干［10］。全過程需避光操作［11］。

1.2.2 類胡蘿卜素的測定方法 將1.2.1處理好的樣品用石油醚溶解，定容至10 mL［12］，需避光操作。450 nm處測定吸光值。根據Beer-Lambert定律，每克枸杞樣品中類胡蘿卜素含量(mg/g)按式(1)計算［13］:

式中:

m——樣品中類胡蘿卜素含量，mg/g;

A——檢測到的枸杞樣品的吸光值;

V——樣品液體積，mL;

2 480——在1 cm光程長的比色杯中1 g/L枸杞樣品提取液的理論吸收值;

m1——枸杞樣品的質量，g。

1.2.3 主要類胡蘿卜素的HPLC測定方法

(1)標準溶液的配制:用電子天平準確稱取β-胡蘿卜素1 mg、玉米黃素1 mg和玉米黃素雙棕櫚酸酯2 mg，加少量二氯甲烷溶解，用流動相定容至10 mL，分別配成100，200 μg/mL的標準溶液，避光操作，－30℃避光保存備用。

(2)將1.2.1處理好的樣品用流動相溶解，定容至10 mL，避光操作，備用。

(3)色譜條件:柱溫:25℃;流動相:甲醇∶正己烷∶二氯甲烷∶乙腈=15∶20∶20∶40(體積比)，等度洗脫;檢測波長:450 nm;進樣量:10 μL;流速:1.0 mL/min。保留時間定性。峰面積定量。

2 結果與分析

2.1 不同產地的枸杞中類胡蘿卜素含量

類胡蘿卜素是枸杞中的重要活性成分之一，具有抗氧化的作用。由圖1可知，不同產地的枸杞中類胡蘿卜的含量差異很大，含量由高到低依次為:青海＞中寧＞固原＞內蒙＞南梁＞新疆＞甘肅＞惠農。青海枸杞的類胡蘿卜素含量最高，可達2.10 mg/g，惠農枸杞的類胡蘿卜素含量最低，為0.41 mg/g，兩者之間差了5倍。由此可知，不同產地枸杞中類胡蘿卜素的含量差異顯著。類胡蘿卜素是枸杞的主要色素，其含量直接影響枸杞的顏色，從而間接影響枸杞的感官品質。

圖1 不同產地的枸杞中類胡蘿卜素含量Figure 1 The contents of carotenoids of Lycium barbarum L.in different areas

2.2 高效液相色譜法檢測枸杞中的主要類胡蘿卜素

2.2.1 標準曲線的建立 將玉米黃素標準品、β-胡蘿卜素標準溶液分別稀釋到 5，10，25，50，100 μg/mL。將玉米黃素雙棕櫚酸酯標準品稀釋到 20，50，80，100，200 μg/mL，重復測定3次。繪制標準曲線。根據信噪比S/N=3，測得3種類胡蘿卜素的檢出限，結果見表1。由表1可知，在相應的線性濃度范圍內，R2均大于0.999 5，呈良好的線性關系，可以滿足定量分析的要求。3種類胡蘿卜素標準品及惠農枸杞樣品的色譜圖見圖2、3。對比圖2和圖3，發現玉米黃素、β-胡蘿卜素和玉米黃素雙棕櫚酸酯的標準品和樣品的出峰時間一致，峰型良好，符合定量檢測的要求［6］。

表1 3種類胡蘿卜素標準品的標準方程、相關系數及檢出限Table 1 Standard curve of three kinds of carotenoids

圖2 標準品色譜圖Figure 2 Chromatogram of standards

圖3 惠農枸杞樣品色譜圖Figure 3 Chromatogram of the Lycium barbarum L.in Huinong

2.2.2 方法準確性試驗 分別取3種標準品混合溶液，重復進樣6次。發現3種標準品的色譜峰保留時間波動不超過0.1 min。記錄3種標準品的峰面積，計算得玉米黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯的峰面積RSD分別為0.27%，0.21%，0.19%，表明試驗精密度良好。

取枸杞樣品，按1.2.1樣品處理方法對樣品進行前處理，分別于 0，2，4，6，8，12 h 進樣 10 μL，計算得玉米黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯的峰面積RSD分別為1.27%，1.96%，2.04%，表明枸杞樣品溶液在 12 h內穩定性較好。

取同一種枸杞樣品3份，按1.2.1樣品處理方法對樣品進行平行前處理，分別進樣10 μL，按照外標法定量，計算得玉米黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯含量的RSD分別為 1.33%，0.92%，1.17%，表明本方法重現性良好。

精密稱取4份2 g左右的枸杞，第1份為空白，在另外3份中分別準確加入濃度分別為50，50，100 μg/mL的3種類胡蘿卜素標準品各1 mL，按照1.2.1方法將4份樣品進行處理，重復測定5次，測定標樣回收率。計算得玉米黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯的回收率分別為96.6%，90.8%，103.9%。本試驗的精密度、穩定性、重現性、回收率表現良好，說明本方法可以滿足不同產地枸杞干果中玉米黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯的定量要求。

2.2.3 不同產地枸杞中幾種主要類胡蘿卜素含量測定結果

不同產地的枸杞樣品按1.2.1方法進行處理，按1.2.3方法測定，平行測定3次，結果見表2。由表2可知，枸杞中3種類胡蘿卜素含量從高到低，依次是:玉米黃素雙棕櫚酸酯＞玉米黃素＞β-胡蘿卜素。其中，玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量是枸杞中最主要的類胡蘿卜素，是類胡蘿卜素存在的主要形式，可以作為枸杞的特征類胡蘿卜素。其它類胡蘿卜素酯的含量較少，且類胡蘿卜素酯生理活性意義不大［14］，所以本試驗沒有進行研究。

不同產地的枸杞中β-胡蘿卜素含量最高的是青海產的，含量為18.61 μg/g，而枸杞是自然界中β-胡蘿卜素含量最高的物質之一，青海產的枸杞可以作為β-胡蘿卜的天然來源之一。不同產地枸杞中玉米黃素含量最高的也是青海產的枸杞，含量為179.81 μg/g。枸杞中，玉米黃素和β-胡蘿卜素可以合成玉米黃素雙棕櫚酸酯，而且具有重要的生理活性［15］，其含量是評價枸杞品質的一項重要指標。從這個角度來說，青海產的枸杞是最好的。

表2 不同產地枸杞類胡蘿卜素含量測定結果Table 2 The content of carotenoids in wolfberry of different origins 2

2.3 聚類分析

使用 SPSS 19.0軟件對不同產地的枸杞中β-胡蘿卜素、玉米黃素、玉米黃素雙棕櫚酸酯和類胡蘿卜素的含量進行了系統聚類分析，結果見圖4。聚類分析是將樣品按照品質特性相似程度逐漸聚合在一起，相似度最大的優先聚合在一起，最終按照類別的綜合性質多個品種聚合，從而完成聚類分析的過程［16］。由圖4可知，中寧、固原、青海的枸杞的相似程度較高，新疆、甘肅、南梁、惠農、內蒙古的相似程度較高。所以，8個不同產地的枸杞干果樣品一共分為兩大類，其中中寧、固原、青海的枸杞樣品為第一大類，其余5個產地的枸杞為第二大類。

圖4 不同產地枸杞樣品聚類分析圖Figure 4 The clustering diagram of Lycium barbarum L.in different areas

3 結論

本試驗利用高效液相色譜法測枸杞中β-胡蘿卜素、玉米黃素、玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量，該方法快捷、簡便，可在20 min內使枸杞樣品中的β-胡蘿卜素、玉米黃素、玉米黃素雙棕櫚酸酯完全分離，可以定性、定量分析枸杞中3種類胡蘿卜素。

通過研究了解不同產地枸杞中主要類胡蘿卜素的含量差異，這與不同產地的氣候條件有著密切的關系，但是環境因素只起著一定的影響作用。研究表明，遺傳因素的差異決定了不同產地的枸杞品質的差異性，其中，青海枸杞β-胡蘿卜素、玉米黃素、玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量是8個產地中最高的。

聚類分析的結果顯示，中寧、固原、青海的枸杞聚為一大類，其他產地的枸杞聚為一類，說明中寧、固原、青海的枸杞中主要類胡蘿卜素含量相似性較大，而與其他產地枸杞比較差異相對較大，從而區分明顯。

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