高效液相色譜法測定復(fù)方丹參片中三七皂苷的含量

趙曉麗 馬 艷

河南省駐馬店市食品藥品檢驗(yàn)所，河南駐馬店 463000

復(fù)方丹參片作為傳統(tǒng)的中藥制劑，多成分、多靶點(diǎn)是其主要特點(diǎn)［1］，由丹參、三七和冰片三種藥組成，臨床上具有擴(kuò)張冠脈、保護(hù)心肌、抗心律失常、降血脂等藥理作用，在治療心腦血管系統(tǒng)疾病有明顯作用［2-3］。三七是組成復(fù)方丹參片的重要藥物，三七的主要有效成分是人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1，筆者從事藥物檢驗(yàn)研究多年，發(fā)現(xiàn)有廠家在制劑生產(chǎn)過程中為降低成本偷工減料而降低三七皂苷含量［4］，致使藥品質(zhì)量和療效產(chǎn)生很大得差異，現(xiàn)為全面考察復(fù)方丹參片的質(zhì)量狀況，采用HPLC法，對八個(gè)不同廠家的復(fù)方丹參片中三七皂苷類成分進(jìn)行對比研究，過程概述如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260高效液相色譜儀（250mm×4.6mm，5μm），BP211D型電子分析天平（上海樹信儀器儀表有限公司），F(xiàn)W-80型高速萬能粉碎機(jī)（鶴壁市鑫天鶴儀器儀表有限公司），電熱恒溫水浴鍋（天津因特萊斯儀器有限公司）。對照品：三七皂苷（批號：110745-201318），中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 藥品分析來源

廣州白云山制藥、廣西日田藥業(yè)、安徽華佗國藥廠、通化頤生藥業(yè)、濟(jì)南宏濟(jì)堂制藥、長春新安藥業(yè)、北京北衛(wèi)藥業(yè)、吉林省百年六福堂藥業(yè)八個(gè)廠家所生產(chǎn)的各三個(gè)批次的復(fù)方丹參片作為質(zhì)量研究的樣品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜準(zhǔn)備

色譜柱：Thermo-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05％磷酸溶液梯度洗脫；流速1.0mL/min；柱溫17℃，紫外線檢測波長：203nm，進(jìn)樣量為20μL。

2.2 試驗(yàn)配置

對照品三七皂苷配置：稱取對照品3.0mg，加甲醇得61.00μg/mL。

不同廠家復(fù)方丹參片試驗(yàn)品溶液的制備：糖衣片刮去糖衣，研細(xì)（過篩），精密0.5g，加入乙醚10mL，超聲5min，過濾，濾渣揮干溶劑，稱重，過夜，置80℃水浴2h，精密吸取上清液1.00mL，加于StrataTMC18-E固相萃取小柱上進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，用甲醇補(bǔ)足丟失，充分混合，濾過，取濾液。

陰性對照配置：按2010版藥典［5］中復(fù)方丹參片處方，取除三七外的剩余藥材制成缺三七的陰性對照品，按上述不同廠商的復(fù)方丹參片的試驗(yàn)溶液配置方案進(jìn)行配置。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

三七皂苷：取標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，分別稀釋成82，60、62.35、43.25、32.15、20.25、12.25μg/mL的對照品溶液，進(jìn)樣，按2.1中條件所述測定峰面積。坐標(biāo)中以信號強(qiáng)度為Y軸，三七皂苷質(zhì)量濃度為X軸繪成曲線，求得Y=1004.4X-0.7496。r=0.9994，線性范圍12.25～82.60μg/mL。見圖1。

圖1 三七皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 對照品（三七皂苷）HPLC法色譜圖（1表示三七皂苷）

圖3 樣品HPLC法色譜圖（1表示三七皂苷）

圖4 空白溶劑HPLC法色譜圖

圖5 陰性樣品HPLC法色譜圖

2.4 精密度分析

取對照品溶液20μL，五次進(jìn)樣，測峰面積，計(jì)算RSD，得0.51％，表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性分析

將2.2項(xiàng)下制備的試驗(yàn)品溶液，24h內(nèi)每隔4h測定峰面積。峰面積RSD為0.21％，表明在一天內(nèi)測定是穩(wěn)定準(zhǔn)確的。

2.6 重復(fù)性分析

將2.2項(xiàng)下制備的試驗(yàn)品溶液，平行處理6份，按照應(yīng)用高效液相色譜法測定峰面積。得峰面積RSD為0.81％，說明重復(fù)性復(fù)合要求。

2.7 樣品檢測

將2.2項(xiàng)下制備試驗(yàn)品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算樣品含量，每個(gè)廠家的三個(gè)批次的三七皂苷成分計(jì)算取平均值，然后將每個(gè)廠家的平均測定值進(jìn)行對比研究。

表1 不同廠家三七皂苷含量平均值比較（±s）

表1 不同廠家三七皂苷含量平均值比較（±s）

廠家 三七皂苷含量均值 廠家 三七皂苷含量均值廣州白云山制藥 0.1540±0.0001 濟(jì)南宏濟(jì)堂制藥 1.3297±0.001廣西日田藥業(yè) 0.1750±0.0001 長春新安藥業(yè) 1.3912±0.002安徽華佗國藥廠 0.7773±0.002 北京北衛(wèi)藥業(yè) 1.5217±0.002通化頤生藥業(yè) 0.8311±0.001 吉林省百年六福堂藥業(yè) 3.1245±0.001

表2 SNK檢驗(yàn)結(jié)果

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)整理和分析，對八個(gè)廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片的三七皂苷含量進(jìn)行聚類分析，并繪制樹狀圖，廠內(nèi)不同批次之間進(jìn)行組內(nèi)方差檢測，應(yīng)用SNK檢驗(yàn)法對各個(gè)廠家的樣本均值含量兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 含量比較

8個(gè)不同廠家復(fù)方丹參片中三七皂苷含量平均值比較，F(xiàn)=155.231，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

3.2 SNK檢驗(yàn)結(jié)果

北京北衛(wèi)藥業(yè)、濟(jì)南宏濟(jì)堂與長春新安藥業(yè)復(fù)方丹參片皂苷類含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），安徽華佗、通化頤生藥業(yè)樣品皂苷類含量兩兩比較后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），廣州白云山制藥與廣西日田藥業(yè)樣品皂苷類含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各廠家兩兩之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

4 討論

復(fù)方丹參片中三七藥材的比例僅次于丹參，是該復(fù)方制劑的重要成分［6-7］，2010年版《中國藥典》［8］只規(guī)定了丹酚酸B、丹參酮ⅡA的含量限度，對三七皂苷的則無具體限定，而三七皂苷具有肝腎功能保護(hù)、抗肺纖維化等作用［9-10］，其成分的含量比例意義重大，故分析三七皂苷類成分含量在復(fù)方丹參片質(zhì)量控制上具有重要的臨床意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同一廠家不同批號間含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，然而不同廠家差異很大，其中北京同仁堂樣品含量最高，達(dá)3.124％，吉林百年六福堂藥業(yè)生產(chǎn)的樣品，含量不足0.3％。不同廠家生產(chǎn)的三七皂苷成分相差10倍之多，這就明顯影響了復(fù)方丹參片的治療有效率。劉再娥等［12］的研究顯示建議復(fù)方丹參片中皂苷含量之和達(dá)到0.6％以上能取得較好的臨床療效。

由于同一種藥材，不同的產(chǎn)地，不同的品種（野生或栽培），不同的生長環(huán)境、土壤、氣候等的影響，使藥材的質(zhì)量差異較大，同時(shí)，如果生產(chǎn)廠家生產(chǎn)工藝及管理不當(dāng)，也會(huì)造成有效成分得損失［11-13］，所以建議含量較低得廠家，應(yīng)重視藥材的來源及質(zhì)量，完善制備工藝，提供產(chǎn)品質(zhì)量。同時(shí)現(xiàn)在不乏有為降低成本而偷工減料的廠家，由于三七屬于貴細(xì)藥材，一些廠家為了降低成本，采用少投料，用劣藥來降低成本，惡意競爭［14］，對此藥品監(jiān)管部門應(yīng)引起高度重視。三七皂苷含量目前沒有一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［15-16］，為了臨床用藥的有效，建議新版藥典添加三七皂苷含量限度，以更好地為臨床患者服務(wù)。當(dāng)然，高效液相色譜法分析復(fù)方丹參片三七皂苷類成分含量也有一定的不足，這也需要我們進(jìn)行改進(jìn)。

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