補陽還五湯和星蔞承氣湯對腦缺血大鼠神經元突觸重塑及膠質源性神經營養因子和神經生長因子表達的影響

補陽還五湯和星蔞承氣湯對腦缺血大鼠神經元突觸重塑及膠質源性神經營養因子和神經生長因子表達的影響

劉會賢劉敬霞俞維黑長春1李娟劉洋李晶晶

(寧夏醫科大學附屬回醫中醫醫院，寧夏吳忠750004)

摘要〔〕目的觀察補陽還五湯和星蔞承氣湯對腦缺血大鼠神經元突觸重塑的作用及其對膠質源性神經營養因子(GDNF)、神經生長因子(NGF)和神經生長相關蛋白-43(GAP-43)、突觸后致密物-95(PSD-95)表達變化的影響。方法120只大鼠隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平組、星蔞承氣湯和補陽還五湯組；線栓法制備大腦中動脈阻塞模型；灌胃用藥并分別于14 d、28 d取材；電子透射電鏡觀察神經元突觸變化，免疫組織化學法檢測GAP-43、PSD-95、NGF、GDNF表達變化。結果與假手術組比較，14 d模型組GDNF表達明顯減弱(P<0.01)，28 d模型組GAP-43表達明顯減弱；與模型組比較，補陽還五湯14 d和28 d組 GAP-43、PSD-95、NGF、GDNF表達均明顯增強(P均<0.05)，14 d星蔞承氣湯組NGF表達顯著增強(P<0.01)，28 d星蔞承氣湯組GDNF表達顯著增強(P<0.01)；與尼莫地平比較，14 d補陽還五湯組 PSD-95、NGF、GDNF表達均明顯增強(P均<0.05)，28 d補陽還五湯組PSD-95表達顯著增強(P<0.05)；與14 d比較，28 d補陽還五湯組PSD-95表達顯著增強(P<0.01)。結論補陽還五湯可明顯促進缺血后神經元突觸重塑，其機制可能是通過上調缺血腦組織中NGF、GDNF的表達從而使GAP-43、PSD-95表達增加而實現。星蔞承氣湯可以上調缺血腦組織早期NGF表達而其遠期作用不明顯。

關鍵詞〔〕腦缺血；補陽還五湯；星蔞承氣湯；神經生長因子；膠質源性神經營養因子；神經生長相關性蛋白-43；突觸后致密物-95

中圖分類號〔〕R285.5〔

基金項目：寧夏醫科大學特殊人才項目(XT200911)

通訊作者：劉敬霞(1970-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事中醫藥防治老年病研究。

1寧夏醫科大學基礎醫學院

第一作者：劉會賢(1987-)，女，住院醫師，碩士，主要從事中醫藥防治老年病研究。

腦缺血后的大腦功能可塑性機理研究一直是腦科學研究的熱點，研究表明，神經元突觸對缺血性損傷極為敏感，缺血性腦損傷會導致神經元突觸數目、功能、結構的變化，這種變化直接影響到神經信息的傳遞〔1，2〕。神經生長因子(NGF)是具有神經元營養和促突起生長雙重生物學功能的一種神經細胞生長調節因子，可以上調神經生長相關蛋白43(GAP-43)表達，促進突觸重建，對神經元起保護作用〔3～5〕。近年研究發現中醫藥可以通過各種機制促進缺血后神經元突觸重塑從而發揮腦保護作用〔6，7〕。本研究探討補陽還五湯和星蔞承氣湯對腦缺血神經元突觸重塑的作用及機制。

1材料與試劑

1.1動物SD大鼠，普通級，120只，3～4月齡，體重(300±50)g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK(寧)2011-0001。飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心動物飼養室，以標準固型普通飼料分組喂養，每組12只。動物飼養室溫度(26±1)℃，相對濕度50%。

1.2試劑和儀器6.5%水合氯醛(寧夏醫科大學附屬醫院制劑中心提供，批號H20080018)。NGF(PR-0305)、膠質源性神經營養因子(GDNF，SC-328)、GAP-43(PM-0275)、突觸后致密物(PSD)-95(PR-0286)、DAB顯色劑等，以上試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3藥物

1.3.1補陽還五湯方生黃芪120 g、歸尾6 g、地龍6 g、川芎3 g、桃仁3 g、紅花3 g，生藥總量141 g；由寧夏醫科大學中醫門診部藥劑科提供，方中所用生藥材去除雜質，按組方劑量配比，加入生藥材10倍量水，浸泡60 min后用TC-15套式恒溫器250 V電壓加熱煎煮；沸騰后將電壓調低至150 V，保持微沸狀態煎煮30 min，濾取煎液；藥渣再加入生藥材8倍量的水，浸泡30 min后煎煮，保持微沸狀態煎煮30 min，濾取煎液；合并兩次煎液，將藥液于恒溫水浴鍋(100 ℃)蒸發水分至濃稠狀，濃縮至藥液含生藥2.6 g/ml，4 ℃保存備用；臨用前加蒸餾水稀釋至生藥材含量為1.3 g/ml。

1.3.2星蔞承氣湯方全瓜蔞30 g、膽南星6 g、生大黃9 g、芒硝9 g，生藥總量54 g。由寧夏醫科大學中醫門診部藥劑科提供，具體煎藥方法同補陽還五湯，其中大黃后下，芒硝沖溶。將藥物濃縮至1.0 g/ml，方法同上，4 ℃保存備用；臨用前加蒸餾水稀釋至生藥材含量為0.5 g/ml。

1.3.3尼莫地平片拜耳醫藥保健有限公司提供，30 mg/片，批號：H20003010。

1.4方法

1.4.1分組與給藥SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、尼莫地平組、星蔞承氣湯組、補陽還五湯組；后四組根據術后分批取材的時間點又各分為14 d、28 d組；每組12只。所有動物于動物清醒后按相應分組開始灌胃給藥，給藥劑量按動物與人體表面積折算：補陽還五湯13.0 g·kg-1·d-1；星蔞承氣湯5.0 g·kg-1·d-1；尼莫地平10.8 mg·kg-1·d-1。每周稱重1次大鼠體重，按體重變化加減用量，模型組和假手術組以蒸餾水代替，連續灌胃14 d。

1.4.2動物模型的制備參照改良的Longa法制備局灶性腦缺血動物模型。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待完全麻醉后，仰臥位固定大鼠，頸前正中切口，左側鈍性分離頸總動脈；分離頸內外動脈，穿線備用；于頸外動脈近動脈分叉處剪口，栓線穿入頸內動脈，緩慢推進，直至感覺有阻力為止，穿線成功后縫合皮膚。假手術組除不穿入栓線外，其余操作相同。手術過程中保持大鼠肛溫(37.0±0.5)℃，保持室溫(26±1)℃。

1.4.3 取材造模當天開始灌胃，術后連續灌胃14 d，分別于14、28 d進行神經功能評分；麻醉大鼠，4%的多聚甲醛溶液灌注固定后斷頭取腦，于冰盤上迅速分離大腦半球，取左側半球，自額極向后至枕極剔除腦組織3 mm，向后冠狀切取腦組織1 mm，旁開3 mm切取3塊1 mm×1 mm×1 mm標本用4%戊二醛溶液固定，待做電鏡檢測；再依次向后冠狀切取2 mm厚的腦組織用4%多聚甲醛溶液固定，待做腦組織病理檢測和免疫組化指標測定。

1.4.4指標檢測

1.4.4.1電鏡標本制作將所取腦組織切成1 mm3的小塊，浸入2.5%戊二醛磷酸緩沖液(pH7.2)固定48 h。1%四氧化餓后固定1 h。丙酮逐級脫水，包埋。LKB-5超薄切片機切片，厚度為50 nm。醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色。透射式電子顯微鏡H-600照相，加速電壓80 kV。

1.4.4.2免疫組化步驟切片常規脫蠟至水；3%過氧化氫室溫避光滅活10 min，去離子水沖洗一遍，切片置于枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中微波熱修復10 min，自然冷卻至室溫；5%山羊血清室溫封閉20 min，濾紙吸干，滴加一抗，4 ℃孵育過夜，室溫放置10～15 min；滴加生物素標記二抗，37 ℃孵育30 min；滴加新鮮配制的DAB顯色劑，顯微鏡下控制顯色時間，自來水終止顯色。以上各步驟間均以0.01 mol/L PBS(pH7.4)清洗5 min×3。最后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照采用PBS緩沖液代替一抗，余相同。GAP-43、PSD-95、NGF、GDNF均按照以上步驟進行。

1.4.4.3陽性表達觀察及測定每組取6張免疫組化切片，每張切片選取5個視野，利用奧林帕斯 DP Ctroller 3.1.1.267 圖像采集系統拍照，固定相機光源亮度。采用Image Pro Plus 6.0圖像全自動分析系統分析反映NGF、GDNF、GAP-43及PSD-95的表達。

1.5統計學處理采用SPSS18.0軟件進行多因素方差分析、最小顯著差法(LSD-t)、秩轉換的非參數檢驗。

2結果

2.1電鏡下神經元突觸變化假手術組細胞器形態結構未見異常；模型14 d組大鼠腦組織超微結構破壞明顯。模型28 d組大鼠神經細胞超微結構改變較14 d模型組改善，細胞質明顯水腫，細胞器數量顯著減少；線粒體水腫，嵴的數量減少，排列紊亂，部分嵴和膜融合，線粒體有致密化現象，部分核膜融合，粗面內質網脫顆粒，游離核糖體數量明顯減少。尼莫地平14 d組神經元周圍輕度水腫，細胞器數量減少；神經元線粒體部分嵴和膜融合，粗面內質網脫顆粒現象，游離核糖體數量減少。尼莫地平28 d組神經元超微結構改變較14 d組改善，線粒體有空化，出現次級溶酶體。星蔞承氣湯14 d組和28 d組神經元超微結構較模型組改善，其中28 d組有脂滴和次級溶酶體出現。補陽還五湯14 d組線粒體輕度病變，突觸小泡聚集成堆，突觸內線粒體輕度改變；補陽還五湯28 d組線粒體改變輕微，細胞核膜稍有不整形，突觸內突觸小泡和線粒體的改變輕微。

2.2大鼠腦組織GAP-43變化假手術組可見棕黃色GAP-43陽性表達，與模型組比較，14 d和28 d補陽還五湯組GAP-43表達明顯增強(P<0.01，P<0.05)；與星蔞承氣湯組比較，14 d和28 d補陽還五湯組GAP-43表達明顯增強(P<0.05)；各組28 d GAP-43表達均較14 d組明顯減弱，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠腦組織GAP-43、PSD-95、NGF及GDNF表達水平比較

與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與尼莫地平組比較：5)P<0.05，6)P<0.01;與星蔞承氣湯組比較：7)P<0.05，8)P<0.01；與14 d組比較：9)P<0.05，10)P<0.01

2.3大鼠腦組織PSD-95變化假手術組可見棕黃色PSD-95陽性表達。與模型組及各藥物組比較，14 d和28 d補陽還五湯組PSD-95表達均明顯增強(P<0.05)，且補陽還五湯28 d組PSD-95表達較14 d組顯著增強(P<0.01)。見表1。

2.4大鼠腦組織NGF變化假手術組大鼠NGF呈棕褐色弱陽性表達。與模型組比較，14 d補陽還五湯組、星蔞承氣湯組NGF表達均顯著增強(P<0.01)，28 d尼莫地平組和28 d補陽還五湯組NGF表達顯著增強(P<0.01)；與尼莫地平組比較，14 d補陽還五湯組NGF表達顯著增強(P<0.01)；與星蔞承氣湯組比較，14 d補陽還五湯組NGF表達有升高趨勢，但未顯示統計學意義(P>0.05)；與14 d組比較，28 d模型組及尼莫地平組NGF表達均明顯減弱(P<0.05)，28 d補陽還五湯和星蔞承氣湯組顯著減弱(P<0.01)。

2.5大鼠腦組織GDNF變化假手術組GDNF呈棕黃色，出現弱陽性表達。與模型組比較，14 d和28 d尼莫地平組GDNF表達明顯增強(P<0.05)，14 d和28 d補陽還五湯組及28 d星蔞承氣湯組GDNF表達均顯著增強(P<0.01)；與尼莫地平及星蔞承氣湯組比較，14 d補陽還五湯組GDNF表達顯著增強(P<0.01)；與14 d組比較，模型組、尼莫地平及補陽還五湯組GDNF表達均顯著降低(P<0.01)。

3討論

突觸結構是大腦神經元間進行神經信息傳遞的物質結構基礎，作為神經系統的重要結構單位，突觸的數量及其結構完整性對維持大腦功能的正常發揮起到了至關重要的作用。95PSD-95是突觸后致密物質中的一個主要蛋白，在腦組織內廣泛分布，其在介導和整合突觸信號傳遞過程起到了重要作用〔8〕。研究表明它直接參與了缺血信號的轉導，對突觸功能和神經元的存活具有明顯影響，PSD的改變直接影響突觸的傳遞功效〔9～11〕。GAP-43是近年來分離鑒定的一種鈣調蛋白結合胞膜磷酸蛋白，在神經元的發育和再生過程中，GAP-43伴隨著軸突的生長大量合成，是軸突生長的一種標記物〔12〕。研究發現，腦缺血后神經元突觸重塑相關蛋白的表達隨缺血時間的變化而變化，其表達與缺血損傷的程度密切相關〔13〕。腦梗死后腦內GAP-43表達在缺血再灌注1 w時即達到高峰，2 w后開始下降且中動脈栓塞后3～14 d缺血半暗帶區GAP-43含量升高與患肢功能恢復同步進行〔14，15〕。已有的研究發現補陽還五湯可以通過促進GAP-43和突觸素-1(Synapsins-1)蛋白表達而促進缺血后神經元突觸重塑〔16〕。本研究認為，具有益氣活血通絡作用的補陽還五湯促進腦缺血損傷后神經元突觸重塑的作用更為顯著和持久。

NGF是具有神經元營養和促突起生長雙重生物學功能的一種神經細胞生長調節因子。腦損傷時腦內源性NGF在皮層和海馬區域的表達增加，對神經元起保護作用〔17，18〕。GDNF是由Lin等〔19〕于1993年從大鼠膠質細胞系B49分離純化出的一種具有神經營養作用糖基化二硫鍵結合的同二聚體蛋白質。體外培養和動物體內實驗研究發現，GDNF對中樞和外周運動神經元、感覺神經元及交感神經元等多種神經元也具有同等營養作用，在促進神經元存活、生長、分化、神經再生、軸突形成及軸突的可塑性等方面具有其他神經生長因子不可替代的作用。近年來的研究發現，腦缺血后神經營養因子表達的增加對神經元突觸重塑起促進作用〔20，21〕，而中醫中藥促進缺血損傷后神經營養因子的表達已有大量研究〔22，23〕。本研究認為，早期應用補陽還五湯對遠期神經元突觸重塑有促進作用，其發揮作用的機制可能是通過促進NGF、GDNF的表達，進而上調GAP-43、PSD-95水平而實現。星蔞承氣湯可在早期上調NGF表達而其長期作用不明顯，考慮與長期通腑邪熱導滯耗損正氣有關，中風證候多屬本虛標實，因此臨證需中病即止，扶正兼顧祛邪方可取效最佳。

4參考文獻

1Bolay H,Gursoy Ozdemir Y,Sara Y.Persistent defect in transmitter release and synapsin phosphorylation in cerebral cortex after transient moderate ischemic injury〔J〕.Stroke,2002;33(3):1369-75.

2王慧娟，蘇麗英，李陳莉，等.大鼠腦缺血后突觸體素與突觸密度的關系〔J〕.解剖學雜志，2004；27(6)：642-5.

3Saito A,Narasimhan P,Hayashi T,etal.Neuroprotective role of aproline-rich Akt substrate in apoptotic neuronal cell death after stroke:relationships with nerve growth factor〔J〕.Neuroscience,2004;24(7):1584-93.

4Schwy zer L,Mateos JM,Abegg M,etal.Physiological and morphological plasticity induced by chronic treatment with NT-3 or NT-4/5 in hippocampal slice cultures〔J〕.Eur J Neurosci,2002;16(10):1939-48.

5江天麗，鄭金甌，余璐，等.顳葉癲大鼠海馬齒狀回NT-3表達與突觸密度變化的相關性研究〔J〕.廣西醫科大學學報，2011；28(1)：42-4.

6崔方圓，翟建英，鄒蔚萌，等.三七通舒膠囊對腦梗死后不同恢復時點Syn和PSD-95表達的影響〔J〕.中成藥，2008；30(1)：31-4.

7韓肖華，黃曉琳，王熠釗，等.電針結合重復經顱磁刺激對腦缺血大鼠海馬突觸素的影響〔J〕.中國康復醫學雜志，2009；24(12)：1057-60.

8Craven SE,Bredt DS.PDZ proteins organize synaptic signaling pathways 〔J〕.Cell,1998;93(4):495-8.

9Gardoni F,Schrama LH,Kamal A,etal.Hippocampal synaptic plasticity involves competition between Ca2+/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ and postsynaptic density 95 for binding to the NR2A subunit of the NMDA receptor〔J〕.J Neurosci，2001;21(5):1501-9.

10Martone ME,Jones YZ,Young SJ,etal.Modification of postsynaptic densities after transient cerebral ischemia:aquantitative and three dimensional ultrastructural study 〔J〕.J Neurosci,1999;19(6):1988-97.

11Hu BR,Park M,Martone ME,etal.Assembly of proteins to postsynaptic densities after transient cerebral ischemia 〔J〕.Neurosci,1998;18(2):625-33.

12江愛娟，胡建鵬，王鍵，等.益氣活血方和補腎生髓方對大鼠腦缺血恢復期GAP-43和SYP表達的影響〔J〕.中國中醫藥科技，2008；15(6)：418-9.

13劉洋，孫建寧，董世芬，等.永久性局灶性中動脈阻斷腦缺血(pMCAO)模型大鼠腦內突觸相關蛋白表達的免疫組織化學觀察〔J〕.中國比較醫學雜志，2012；22(8)：43-7.

14趙曉科，肖農.麻黃堿對腦缺血大鼠運動功能恢復的影響及分子機制研究.中國康復醫學雜志，2005；20(3)：172.

15Stroemer R P,Kent TA,Hulsebosch CE.Enhanced neocortical neural sprouting,synaptophysin,and behavioral recovery with D-amphetamina therapy after neocortical in farction in rats〔J〕.Stroke,1998;29(11):2381.

16王海濤，楊明峰，曹曉嵐，等.補陽還五湯聯合運動訓練對腦梗死大鼠神經元突觸重建的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2010；16(13):132-5.

17Saito A,Narasimhan P,Hayashi T,etal.Neuroprotective role of aproline-rich Akt substrate in apoptotic neuronal cell death after stroke：relationships with nerve growth factor〔J〕.Neuroscience,2004;24(7):1584-93.

18Marz P,Heese K,Dimitrades SB,etal.Role of interleukin-6 and receptor in region specific induction of astrocytic differention and neuotrophin experession 〔J〕.Glia,1999;26(3):191-200.

19Lin LF,Doherty DH,Lile JD,etal.GDNF:a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopamanergic neurons〔J〕.Science,1993;26(4):1130-2.

20賈杰，胡永善，吳毅.神經生長因子對大鼠缺血性腦損傷急性期的療效研究〔J〕.神經損傷與功能重建，2011；6(1)：1-5.

21王華，陳澤濤.滋腎通絡方對局灶性腦缺血大鼠腦組織腦源性神經營養因子蛋白含量的影響〔J〕.環球中醫藥，2012；5(8)：569-72.

22劉萬里，董文毅，陳蘇寧，等.BDNF、NGF在大鼠局灶性腦缺血的表達變化及加減補陽還五湯對其影響的實驗研究〔J〕.世界中西醫結合雜志，2010；5(1)：29-31.

23段新芬，李文英，謝寧，等.加減地黃飲子預處理對局灶性腦缺血大鼠腦組織神經生長因子表達的影響〔J〕.現代中西醫結合雜志，2009；18(29)：3537-40.

〔2013-06-25修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)