靈芝孢子粉對脂多糖誘導的人氣道上皮細胞損傷的保護作用

靈芝孢子粉對脂多糖誘導的人氣道上皮細胞損傷的保護作用

姚金福趙婉軍楊波樊湘澤范曉清

(長春中醫藥大學藥學院,吉林長春130117)

摘要〔〕目的探討靈芝孢子粉對脂多糖(LPS)誘導細胞損傷的保護作用及機制。方法對16HBE細胞體外培養，分別給予不同劑量靈芝孢子粉預保護24 h后，給予LPS(1 μg/ml)刺激6 h，采用MTT法檢測氣道上皮細胞活性，檢測細胞上清液中的超氧化歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，白介素-6(IL-6)等。采用Western印跡檢測細胞內核因子(NF)-κB蛋白表達。結果靈芝孢子粉可明顯提高人氣道上皮細胞的活力，顯著降低細胞上清液中MDA、TNF-α、IL-6；顯著提高SOD的含量；并顯著降低細胞內NF-κB蛋白表達。結論靈芝孢子粉對LPS誘導的人氣道上皮細胞損傷有保護作用。

關鍵詞〔〕靈芝孢子粉；人氣道上皮細胞；脂多糖

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：吉林省中醫藥管理局資助項目(2012-074)

第一作者：姚金福(1960-)，男，副教授，主要從事中醫學、中藥學研究。

支氣管哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，氣道上皮細胞可以合成和釋放多種炎癥介質和細胞因子，這些因子是哮喘發病的主要原因，氣道炎癥可以引起上皮細胞分泌炎癥介質，并造成炎癥反應的加重，從而造成上皮細胞的凋亡脫落；同時，還會造成氣道內細胞及組織的改變和氣道重塑〔1～4〕。靈芝孢子粉為擔子菌綱多孔科靈芝屬真菌靈芝生長成熟后散發出來的孢子體，富含多糖、肽、有機鍺、多種氨基酸、脂肪酸及微量元素等成分。孢子粉可改善機體的免疫功能， 減輕放、化療的不良反應。藥理研究表明，靈芝孢子粉可明顯增強人體免疫功能，并對多種腫瘤有明顯的抑制作用〔5～7〕。本研究通過研究靈芝孢子粉對脂多糖(LPS) 致人氣道上皮細胞損傷的影響，評價靈芝孢子粉保護人氣道上皮細胞的作用機制。

1材料與方法

1.1試驗藥物靈芝孢子粉由吉林省長白工坊科貿有限公司提供，經長春中醫藥大學王德友教授鑒定為正品。

1.2試劑人氣道上皮細胞株16HBE(吉林大學基礎醫學院)；丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)，白介素(IL)-6、 腫瘤壞死因子(TNF)-α、核因子(NF)-κBP65抗體等試劑盒購自上海研域生物科技有限公司；改良細胞培養基(DMEM)(高糖)和胎牛血清(上海科敏生物科技有限公司)；LPS(L2880，大腸桿菌055)、B5HNE和四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國Sigma公司)。

1.3儀器超凈工作臺：蘇州安泰BSC-1600型生物潔凈安全柜。細胞計數儀：美國Invitrogen公司。CO2培養箱：美國Nuaire公司。電泳儀：美國伯樂公司。酶標儀：美國伯樂公司。

1.4方法

1.4.1人氣道上皮細胞培養及分組16HBE細胞用含10%胎牛血清DMEM(高糖)完全培養基培養，以1×105/ml接種于24孔板中并置于37℃，飽和濕度CO2培養箱中培養。細胞融合達70%時更換成無血清DMEM(高糖)培養基繼續培養24 h后分組：①空白對照組，無血清DMEM(高糖)培養基培養；②LPS組(LPS 1 μg/ml)；③低靈芝孢子粉組(靈芝孢子粉0.5 g/L)；④中靈芝孢子粉組(靈芝孢子粉1 g/L;⑤高靈芝孢子粉組(靈芝孢子粉2 g/L)。除空白對照組，其余各組使LPS作用6 h后，檢測各項指標。

1.4.2MTT檢測培養細胞加入各濃度靈芝孢子粉培養24 h后，加入1 μg/ml的LPS，繼續培養24 h后每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml)，492 nm波長測定吸光度。計算細胞的存活率。

1.4.3檢測SOD，MDA，TNF-α，IL-6收集各種細胞上清液，按照檢測試劑說明書進行檢測。

1.4.4檢測細胞內NF-κBP65收集各組細胞并加入預冷的RIPA裂解液和相應的蛋白酶抑制劑，4℃，15 000 r/min離心15 min后取上清液，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg上清液經8% SDS-PAGE電泳分離后轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶37℃封閉1 h后，一抗4℃過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育1 h。顯色后，以相應的總蛋白表達水平作為內參照。

1.5統計學處理應用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1靈芝孢子粉對人氣道上皮細胞活力的影響與空白對照組〔(92.11±3.01)%〕相比，LPS組顯著降低16HBE細胞活力〔(52.07±2.15)%〕；而低、中、高濃度各組靈芝孢子粉均能顯著提高細胞活力〔(69.82±2.11)%、(75.12±2.39)%、(79.28±2.52)%〕。見表1。

2.2靈芝孢子粉對人氣道上皮細胞上清液MDA與SOD的影響與空白組相比,LPS組細胞上清液中MDA含量升高，SOD含量降低;各組靈芝孢子粉可降低上清液中MDA含量，升高SOD含量。見表1。

2.3靈芝孢子粉對人氣道上皮細胞上清液TNF-α，IL-6的影響與空白組相比,LPS組細胞上清液中TNF-α，IL-6含量升高;各組靈芝孢子粉可降低上清液中MDA含量，提高SOD含量。見表2。

2.4靈芝孢子粉對人氣道上皮細胞NF-κBP65的影響與空白組(0.11±0.061)相比,LPS組細胞內NF-κBP65含量升高(0.72±0.103);低、中、高劑量組靈芝孢子粉可降低NF-κBP65含量(0.58±0.089、0.39±0.072、0.31±0.121)。見圖1。

表1　靈芝孢子粉對SOD、MDA的影響

與LPS組比較：1)P<0.05，下表同

表2　靈芝孢子粉對TNF-α，IL-6的影響

A：空白組；B：LPS組；C：靈芝孢子粉0.5 g/L；D：靈芝孢子粉1 g/L；E：靈芝孢子粉2 g/L 圖1　各組16HBE細胞中NF-κBP65蛋白水平

3討論

近年來，對哮喘的研究多集中在炎性細胞的浸潤和平滑肌細胞的增殖方面，而對氣道上皮的研究不多。而氣道上皮損傷與氣道炎癥的發生相關，也是導致氣道重塑、哮喘難于治療的重要因素〔8〕。TNF-α、IL-6等多種炎癥介質的啟動子和增強子中都存在著NF-κB序列，NF-κBP65的活化促進炎癥因子的生成〔9,10〕。本實驗結果顯示靈芝孢子粉可減低LPS損傷細胞上清液中的MDA、TNF-α、IL-6，提高SOD，并能減低細胞內NF-κBP65含量。因此，認為靈芝孢子粉有保護氣道上皮細胞損傷作用。

4參考文獻

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〔2014-07-15修回〕

(編輯徐杰)

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