siRNA沉默Bmi－1表達對肺腺癌A549細胞侵襲能力的影響

siRNA 沉默Bmi-1表達對肺腺癌A549細胞侵襲能力的影響

劉丹丹鄭翔宇1，2劉奔劉純青1王藝芳1趙寶霞1孟秀香1

(大連醫科大學診斷學實驗中心，遼寧大連116044)

摘要〔〕目的觀察Bmi-1基因沉默對A549細胞增殖和侵襲影響并初步探討其機制。方法根據四條針對Bmi-1的小干擾RNA(siRNA)序列，將其瞬時轉染到A549細胞中，選擇最有效的一條鏈并構建到逆轉錄病毒真核表達載體pSUPERretro-Neo中，形成重組載體，然后將其穩定轉染至A549細胞中，構建了穩定轉染Bmi-1-shRNA的A549細胞。應用MTT實驗檢測Bmi-1-siRNA對A549細胞體外增殖的影響；Transwell小室觀察其對A549侵襲能力的影響；RT-PCR和明膠酶譜法分別觀察siRNA對A549細胞MMP-2/MMP-9表達及活性的影響。結果Bmi-1 siRNA能夠抑制A549細胞的增殖能力和侵襲能力，Bmi-1 siRNA能夠抑制A549細胞MMP-2/MMP-9的表達和活性。結論Bmi-1 siRNA對A549細胞侵襲能力的抑制和MMP-2/MMP-9的活性降低有關。

關鍵詞〔〕肺腺癌；siRNA；Bmi-1基因；侵襲

中圖分類號〔〕R734〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：遼寧省自然科學

通訊作者：孟秀香(1965-)，女，教授，博士，碩士生導師，主要從事腫瘤細胞生物學研究。

1大連醫科大學檢驗醫學院2河南省中醫院檢驗科

第一作者：劉丹丹(1964-)，女，實驗師，主要從事腫瘤細胞生物學研究。

目前對肺腺癌發生發展確切機制的了解仍較為貧乏，因此研究肺癌侵襲、轉移的發生機制具有重要的臨床意義。Bmi-1最初作為原癌基因被Van Lohuizen等人〔1〕發現，Bmi-1與c-myc基因協同使得B淋巴細胞發生改變從而導致了鼠淋巴白血病〔2〕。近年研究表明，Bmi-1基因在人類一些常見的惡性腫瘤如鼻咽癌、乳腺癌、大腸癌、胃癌等腫瘤中都存在高表達情況〔3～6〕，與腫瘤的增殖和淋巴結轉移密切相關。有關Bmi-1在肺癌中的表達已有報道，非小細胞肺癌(NSCLC)中Bmi-1表達較正常肺組織相比明顯增高〔7〕。并且Bmi-1在肺癌的晚期較肺癌早期表達明顯增高〔8〕，這說明Bmi-1參與了肺癌的發生發展機制。以往研究中，針對Bmi-1基因設計4對發夾式Bmi-1 siRNA質粒，均能抑制子宮頸癌Hela細胞的體內外增殖能力〔9〕。本文研究沉默Bmi-1基因的表達對A549細胞遷移和侵襲的影響。

1材料和方法

1.1細胞培養A549細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基在37℃、5% CO2的CO2培養箱中培養。未轉染的細胞命名為A549-wt，轉染PSUPER-retro-neo-Bmi-1和自由序列的分別命名為A549-siRNA-Bmi-1和A549-ctr。

1.2RT-PCR總RNA用Trizol試劑提取，然后按照TaKaRa的RT-PCR試劑盒說明書進行操作。MMP-2基因上游引物：5′-TGGCAGTGCAATACCTGAAC-3′，MMP-2基因下游引物：5′-CCGTACTTGCCATCCTTCTC-3′；MMP-9基因上游引物：5′-AGTGGCACCACCACA ACA T-3′，MMP-9基因下游引物：5′-TCCTGGGTGTAGAGTCTCTCG-3′；GAPDH上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，GAPDH下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。擴增產物在含0.5%溴乙啶的1%瓊脂糖凝膠電泳中分離。

1.3四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)法檢測細胞增殖能力取對數生長期的三組細胞消化后按每孔細胞數為2×103單細胞懸液接種于96孔板中，設5個復孔，1 d后各組分別取5孔進行實驗，連續測5 d。檢測時每孔加入MTT 10 μl，4 h后小心吸去孔內的液體，加入150 μl DMSO，震蕩15 min，使結晶物完全溶解，酶標儀490 nm測定吸光度。

1.4細胞侵襲試驗按照BD BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber試劑盒說明書要求進行操作。大致如下：將無血清培養基加入小室，然后置于37℃、5%CO2培養箱內2 h。除去培養基，加入濃度為1×105/ml的細胞懸液0.5 ml(無血清)。下室加含10%胎牛血清的培養基0.75 ml。在37℃、5%CO2培養箱內48 h。用棉簽將殘留在上室內表面的細胞拭去。用10%甲醛固定遷移至小室外表面的細胞，0.25%結晶紫染色后在顯微鏡下計數細胞，取5個視野(×400)細胞計數的平均值。

1.5明膠酶譜分析取等量的三組細胞接種在6孔板上，待80%融合時換無血清的1640培養基繼續培養72 h收集上清液。1 000 r/min離心5 min，分裝，-80℃保存。制膠結束后(分離膠含0.1%明膠的)，自冰箱中拿出細胞上清液，加入無β-巰基乙醇的5×上樣緩沖液后進行上樣、電泳。取出PAGE膠，在含2.5%TritonX-100洗脫液震蕩洗滌15 min×4次，加入明膠酶緩沖液，37℃孵育48 h。再進行脫色直至出現清晰條帶。凝膠成像，圖像分析軟件進行定量分析。

1.6統計學方法采用SPSS13.0統計軟件行方差分析。

2結果

2.1Bmi-1 siRNA抑制A549細胞的體外增殖能力MTT法檢測A549細胞每天的吸光度值，A549 Bmi-1 siRNA細胞在第三天及以后的時間OD值明顯低于A549-ctr 和A549-wt兩組細胞，生長速度明顯受到抑制(P<0.05)；而后兩組細胞的生長數值在統計學上無差異(P>0.05)。見表1。

表1　沉默Bmi-1基因對A549細胞體外增值能力的

與A549-siRNA-Bmi-1比較：1)P<0.05

2.2Bmi-1 siRNA抑制A549細胞的侵襲能力Transwell方法檢測沉默Bmi-1基因后對A549細胞侵襲能力的影響，A549-Bmi-1-siRNA細胞組的侵襲能力顯著低于A549-wt和A549-ctr細胞組(P<0.01),而A549-wt和A549-ctr細胞組之間無顯著性差異(P>0.05)。見圖1。

圖1　沉默Bmi-1基因對A549細胞侵襲能力的影響(×400)

2.3沉默Bmi-1表達對MMP-2/MMP-9表達及活性的影響

2.3.1RT-PCR檢測三組細胞中MMP-2和MMP-9 mRNA表達結果A549-Bmi-1-siRNA細胞MMP-2、MMP-9 mRNA的表達比A549-wt和A549-ctr細胞中MMP-2、MMP-9表達明顯降低(P<0.05)。見圖2。

2.3.2明膠酶譜法檢測沉默Bmi-1基因后對MMP-2和MMP-9活性的影響如圖3所示，A549-Bmi-1 siRNA細胞組MMP-2

圖2　RFT-PCR檢測各組細胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達

圖3　沉默Bmi-1基因對A549細胞MMP-2/MMP-9 活性的影響

(active形式)和MMP-9(active形式)顯著低于A549-wt和A549-ctr細胞組(P<0.05)，而A549-wt和A549-ctr細胞組酶譜分析結果無顯著差異(P>0.05)。

3討論

本文結果表明沉默Bmi-1基因能夠減弱A549細胞的體外增殖能力侵襲是惡性腫瘤也是最重要的惡性生物學特征。腫瘤細胞通過細胞膜表面特定的受體與細胞外基質或基底膜中的層黏連蛋白、Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白的黏附在一起，然后通過釋放一些蛋白水解酶類或激活基質中已經存在的酶原來促使基質成分發生降解，癌細胞才得以遷移至被水解的基質空隙中，通過這一方式癌細胞不斷向基質深層侵襲，為下一步的轉移打下了基礎。鋪有人工基底膜Transwell小室是目前檢測癌細胞體外侵襲能力的簡單而有效的方法。Transwell小室實驗中采用的基質膠Matrigel是從EHS小鼠腫瘤中提取的基質成分，富含層黏連蛋白以及Ⅳ型膠原等成分。將基質膠Matrigel鋪在侵襲小室的多孔濾膜上，能夠形成和天然基底膜非常類似的基底膜結構，可以模擬體內的基質狀況。小室下方的血清濃度高于上方，所以，具有侵襲能力的細胞就會朝向高血清濃度方向趨動，穿過人工基底膜和直徑為 8 pm的聚碳酸微孔濾膜。本研究發現干擾組A549細胞成功穿過Matrigel膜和小室濾膜的細胞數較兩個對照組明顯減少，說明轉染Bmi-1-shRNA能夠使肺腺癌細胞侵襲能力明顯降低。

Liotta等〔10〕提出侵襲轉移三步學說：即黏附、降解和移動。其中血管基底膜的降解、破壞是腫瘤侵襲轉移的重要步驟，基質膜是機體阻礙癌細胞侵襲和轉移的重要屏障。當癌細胞脫離原發灶遷移到細胞外基質時，癌細胞能夠通過分泌多種蛋白水解酶來降解細胞外基質，將基底膜這個阻礙癌細胞侵襲的屏障破壞。癌細胞從血管基底膜的破損處移出進入到血管中，進行血道轉移。從中不難看出，腫瘤細胞侵襲能力是其進行轉移的必需前提，因而非常重要。而達到侵襲目的的前提是其能分泌一些蛋白酶來降解細胞外基質。能降解細胞外基質的蛋白酶包括四種，其中基質金屬蛋白酶(MMPs)是所有蛋白酶中最重要的一種。在癌細胞侵襲和轉移的這一復雜過程中，MMPs起著非常重要的作用，是一類依賴鋅離子的細胞外蛋白水解酶，可降解細胞外基質，能促進惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移〔11，12〕。根據其作用底物的類型不同，可將金屬蛋白酶分為五大類，即膠原酶、明膠酶、基質溶解酶、巨噬細胞彈性蛋白酶、膜型基質金屬蛋白酶。這些酶的主要功能是降解各種類型的膠原、明膠蛋白、纖連蛋白、層連蛋白等細胞外基質成分。在這些酶中，最為重要同時研究比較清楚的是明膠酶MMP-9和MMP-2〔13〕，二者可以催化水解細胞間基質成分，降解基膜的主要成分膠原，促進腫瘤細胞向周圍正常組織浸潤〔14〕。Suzuki等〔15〕發現在NSCLC中的MMP-2和MMP-9均有高表達，且MMP-2的表達明顯強于MMP-9，故認為MMP-2在肺癌發生發展中發揮比MMP-9更加重要的作用。本實驗結果顯示高侵襲肺腺癌細胞株A549中，MMP-2的表達及活性也確實高于MMP-9。Bmi-1與腫瘤的侵襲轉移密切相關，但它與MMPs是否有關及其介導通路尚未見報道。本研究結果表明，Bmi-1-shRNA抑制了A549細胞MMP-2/MMP-9 mRNA表達及MMP-2/MMP-9的活性，Bmi-1與肺腺癌的侵襲特性密切相關。

4參考文獻

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〔2014-03-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)