微囊藻毒素—LRHPLC/ESI—MS法檢測與前處理條件優化

摘要：通過對前處理過程中關鍵環節進行單因素不同水平比較，選擇出同相萃取柱、濃縮方式、氮氣流量、水浴溫度、質譜參數等因素的最優實驗方案，建立一種簡便省時及回收效果最佳的前處理流程。采用同相萃取液相色譜一電噴霧串聯四極桿質譜法（HPLCIESI-MS）檢測微囊藻毒素-LR（MC-LR），選用0.2%甲酸甲醇溶液-0.2%甲酸水溶液梯度洗脫、選用HLB小柱、普通氮吹儀濃縮（氮氣流量1.5L/min、水浴溫度38qC）平均回收率為89.3%。質譜優化結果表明：當定量離子質荷比995.8>135錐孔電壓49，碰撞能量54；995.8>375.1錐孔電壓49，碰撞能量50，MCYST-LR靈敏度高且響應值最大。所建立優化的前處理、檢測方法，具有準確度高、靈敏度高、回收率高、分離效果更好的優點，可用于分析水體中痕量MC YST-LR。

關鍵詞：微囊藻毒素-LR；電噴霧；質譜；前處理；優化

文獻標志碼：A

文章編號：1674-5124（2015） 02-0042-04

引言

藍藻水華污染所帶來的主要危害是在有毒藍藻細胞破裂后向水體中釋放多種不同類型的藻毒素，世界上25%～70%的藍藻水華污染可產生藻毒素；在已發現的各種不同藻毒素中，微囊藻毒素（mlcro-cyslin，MC）是一種在藍藻水華污染中出現頻率最高、產生量最大和造成危害最嚴重的藻毒素種類。另據調查發現，飲用水中MC的存在與人群中原發性肝癌和大腸癌的發病率有很大的相關性。MC是一組環狀七肽，分子量為1000左右，由于多肽組成中氨基酸種類的變化，導致了該類毒素的多樣性，目前已鑒定的異構體有60多種，其命名方式為MC-XZ，MC-LR表示其2，4位分別為亮氨酸（leuc，ine，L）、精氨酸（arginine，R）。

微囊藻毒素在環境水中含量很低，檢測干擾大。其檢測手段主要有傳統的小鼠腹腔注射生物分析法，酶聯免疫法，蛋門磷酸酶抑制法等生化分析方法，以及帶紫外檢測器的高效液相色譜法；國外常利用液相色譜與質譜聯用來檢測。液相色譜與質譜聯用法測定微囊藻毒素不僅能定量，還能夠區分MC異構體，但在樣品前處理過程中，不同固相萃取柱、淋洗劑、洗脫劑以及濃縮方式都會直接影響微囊藻毒素的回收率。本文建立以固相萃取分離，利用高效液相色譜一電噴霧電離質譜（HPLCIESI-MS）檢測微囊藻毒素的方法；研究不同固相萃取柱、濃縮方式、優化氮吹儀參數、優化質譜參數等因素對微囊藻毒素一LR分析結果的影響。

1.實驗部分

1.1 儀器和試劑

Wacers高效液相色譜/串聯質譜；Masslynx4.0工作站；Zymark全自動固相萃取儀；HLB固相萃取小柱（500mg，6mL）；C18固相萃取小柱（500mg，6mL）；全自動定量氮吹儀；普通氮吹儀。甲醇、甲酸均為色譜純；水由Millipore純水機制備；MCYST-LR標樣購自Alexs公司。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry300，C18柱（4.6mm×75mmx3.5μm，孔徑300xl0-10m），柱溫：30℃；樣品溫度：室溫，進樣體積：10μL，體積流量：0.2mL/min。流動相梯度見表l。

1.3 質譜條件優化

離子源：ESI+，毛細管電壓：3.90kV，錐孔電壓：49V；離子源溫度：100℃，RF透鏡1：40.0，光圈：0.0，RF透鏡2：0.0，錐孔反吹氣體積流量：50L/h，脫溶劑氣溫度：350℃，脫溶劑氣流量：400L/h，碰撞池壓力：3.Oxl0-3Mbar（1bar=105Pa）。

質量分析器：低端分辨率LM Lensl：12.OV，高端分辨率HM Lensl：12.0V，離子能量1：0.3，入口透鏡電壓：10V，碰撞梯度：1.0，995.8>135碰撞能量：54，995.8>375.1碰撞能量：50，出口電壓：12V，低端分辨率LM Lens2：12.OV，高端分辨率HM Lens2：12.OV，離子能量2：0.6。該實驗考察了錐孔電壓和碰撞能量兩個參數的優化，錐孔電壓調節值設為36，42，49，52V，定量離子995.8>135碰撞能量調節值設為48，50，54，57；定性離子995.8>375.1碰撞能量調節值設為40，46，50，55，質譜分析時比較對MC-LR檢出靈敏度的影響。

1.4 樣品前處理的優化

用5mL甲醇、5mL水活化HLB小柱和C18小柱，流量為5 mL/min；取兩個空門水樣IL，分別加入MC-LR標準100ng，加入5mL甲醇上樣至固相萃取小柱，體積流量為4mUmin；用lOmL5%甲醇水溶液淋洗小柱，用氮氣吹干10min，然后再用5mL甲醇洗脫兩次；合并洗脫液，并用氮吹儀濃縮至lmL，直接進樣分析，根據加標回收率的差異比較不同固相萃取小柱的富集效果。

同時取4個空門水樣，分別加入MC-LR標準100ng，采用固相萃取獲得有機相后，同時利用全自動型氮吹儀和普通氮吹儀兩種濃縮方式，氮吹過程中多次用滴管涮洗氮吹瓶內壁，最終濃縮定容至lmL，直接進樣分析，對比不同濃縮方式對回收率的影響。

取空門水樣分別加入MC-LR標準100ng，固相萃取后采用普通氮吹濃縮樣品，調節一定的水浴溫度，同時緩慢吹入氮氣吹脫進行濃縮。氮氣體積流量設為0.5，1，1.5，2L/min；水浴溫度設為36，37，38，40℃；濃縮定容至lmL直接進樣分析，對比不同氮氣流量和水浴溫度對回收率的影響。

2.結果與討論

2.1 不同固相萃取柱對微囊藻毒素測定結果的影響

采用硅膠鍵合Sep-Pak C18和以聚合物為填料的Oasis HLB兩種小柱富集微囊藻毒素，按照上述1.4方法進行樣品前處理，比較兩種小柱的富集效果。結果表明，Oasis HLB小柱回收率與Sep-PakC18小柱相比提高了20%～25%。由此可見，兩種小柱的富集效果有明顯差異，對于極性強的MC-LR，Oasis HLB小柱的富集效率顯著高于Sep-Pak C18小柱；因為HLB小柱的吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，具有較大的吸附容量；與C18小柱相比，同樣容量規格的HLB小柱吸附劑的表面積增大2～3倍，對極性強的MC-LR富集效率就更高。鑒于HLB固相萃取柱操作簡便、快速，并具有較大吸附能力，所以本方法采用HLB柱。

2.2 不同濃縮方式對MCYST-LR回收率的影響

該研究采用固相萃取獲得有機相后，用普通氮吹代替全自動氮吹，按照上述樣品前處理方法1.4進行分析。取4個空門水樣500mL，分別加入MC-LR標準品100ng、200ng，考察手動氮吹儀和全自動型氮吹儀兩種濃縮方式對MCYST-LR回收率的影響，見圖1。由圖可見，采用普通氮吹濃縮，微囊藻毒素回收效果更佳，相對于全自動型氮吹，用滴管涮洗氮吹瓶內壁是關鍵步驟，很大程度地減少了待測組分的損失，提高了回收率。

2.3 優化氮吹儀參數

本文采用普通氮吹濃縮樣品，調節一定的水浴溫度，同時緩慢吹入氮氣吹脫進行濃縮按照上述樣品前處理方法1.4進行分析。實驗考察了氮氣流量和水浴溫度兩個參數對MCYST-LR回收率的影響，結果見圖2與圖3。氮吹濃縮時，氮氣體積流量允許范圍為0.5～2.0L/min，加熱的原則是增加溶劑揮發速度的同時盡量保證目標物的保留，水浴溫度范圍為36-40℃。由圖可知，氮氣體積流量調節為1.5Lmin，水浴溫度調節為38℃，回收效果更佳，該實驗通過優化這兩個參數，回收率明顯提高，因為氮氣壓力降低，水浴溫度略微降低，減少目標化合物在濃縮過程中的損失，但是氮氣壓力不能過低，壓力過低會延長濃縮樣品的時間。

2.4 錐孔電壓和碰撞能量對MCYST-LR靈敏度

的影響

根據各種MCYST分子結構，選擇ESI（+）作為電離化模式，將MCYST-LR標準品分別配制成lμg/mL的甲醇溶液，通過全掃描方式找出其母離子m/z995.8，使用Daughter掃描的方式選擇特征離子，逐步加大誘導碰撞能量，隨著母離子豐度逐漸減少，子離子豐度逐漸增加。選碎片離子m/z135作為LR的定量離子，m/z375.1作為LR的定性離子，最后在MRM方式中進一步調整碰撞能量，確定其最佳誘導碰撞能量的范圍。實驗考察了錐孔電壓和碰撞能量兩個參數對MCYST-LR檢測靈敏度的影響，結果如表2所示。

由表2可知，定量離子995.8>135錐孔電壓調節為49，碰撞能量調節為54時；定性離子995.8>375.1錐孔電壓調節為49，碰撞能量調節為50時，MCYST-LR靈敏度更高，響應值最大。

3.結束語

由上述結果可以看出，前處理方法和質譜參數的優化對微囊藻毒素-LR測定的影響非常顯著，與C18小柱相比，同樣容量規格的HLB小柱吸附劑的表面積增大2～3倍，對極性強的MC-LR富集效卒就更高；濃縮方式采用普通氮吹儀回收效果更佳；氮吹濃縮時氮氣體積流量調節為1.5L/min，水浴溫度調節為38℃，回收效果較好；質譜參數優化，錐孔電壓和碰撞能量這兩個參數對微囊藻毒素-LR檢測靈敏度的影響較顯著，優化后定量離子995.8>135錐孔電壓調節為49，碰撞能量調節為54時；定性離子995.8>375.1錐孔電壓調節為49，碰撞能量調節為50時，MCYST-LR靈敏度更高，響應值最大。

本文考察了濃縮方式、固相萃取柱、氮吹過程中的參數、質譜參數等前處理方法中涉及的因素比較，提出優化措施，使整個檢測過程更為實用簡便，同時顯著提高了微囊藻毒素-LR的回收率。應用優化后的微囊藻毒素-LR前處理條件和液相色譜聯用電離質譜法檢測，能夠取得更為理想的分析效果，對于微囊藻毒素-LR液相色譜聯用質譜檢測技術的推廣應用具有重要參考價值。