凝膠滲透色譜法測定食用植物油中苯并（a）芘

徐明雅，潘丹杰，金米聰

凝膠滲透色譜法測定食用植物油中苯并（a）芘

徐明雅1，潘丹杰1，金米聰2

（1.杭州市糧油中心檢驗監測站，浙江 杭州 310009；2.寧波市疾病預防控制中心，浙江省微量有毒化學物健康風險評估技術研究重點實驗室，浙江 寧波 315010）

建立簡便、準確的食用植物油中苯并（a）芘測定的凝膠滲透色譜-液相色譜熒光檢測方法。樣品經環己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶解，利用凝膠滲透色譜系統凈化，洗脫液經真空旋轉蒸發濃縮后氮吹至干，乙腈定容后用帶熒光檢測器的高效液相色譜儀測定。結果，苯并（a）芘在0.21～52.50 ng/mL范圍具有良好的線性，檢出限為0.2 μg/kg，最低定量限為0.7 μg/kg，靈敏度高、線性好、范圍寬。三級大豆油、四級菜籽油、一級菜籽油、一級山茶油、芝麻油、橄欖油共6 種不同種類和級別的食用植物油加標樣品中低、中、高3 個添加水平的回收率在98.6%～103.5%之間，相對標準偏差（n=6）在2.98%～4.69%之間。2a跟蹤測定1份芝麻油陽性樣品10次，其平均值為10.94 μg/kg，相對標準偏差為2.12%。建立的方法操作簡單，能有效去除油脂基質的干擾，準確度高，重復性好，克服了GB/T 22509—2008《動植物油脂 苯并（a）芘的測定：反相高效液相色譜法》方法測定苯并（a）芘時氧化鋁活度不易控制的技術難題，檢測批量植物油樣品中苯并（a）芘時效率提高。

凝膠滲透色譜；高效液相色譜；食用植物油；苯并（a）芘

苯并（a）芘，又名3,4-苯并芘（benzo(a)pyrene，BaP），可溶于苯、甲苯、環己烷，少溶于醇，具有高度的脂溶性[1-2]。BaP是多環芳烴類化合物的典型代表化合物，一般來源于有機燃料的不完全燃燒，可在煙草煙霧、汽車尾氣以及油炸煙熏燒烤食物中被檢測到[3]。GB 2762—2012《食品中污染物限量》[4]規定油脂及其制品中BaP限量值為10 μg/kg。

測定BaP的國家標準主要有GB/T 5009.27—2003《食品中苯并（a）芘的測定》[5]和GB/T 22509—2008《動植物油脂：苯并（a）芘的測定：反相高效液相色譜法》[6]。GB/T 5009.27—2003《食品中苯并（a）芘的測定》[5]方法因過程復雜、有毒溶劑用量大、熒光本底干擾多、耗時，檢測靈敏度不高，很難滿足批量檢測的要求。雖然GB/T 22509—2008[6]規定了氧化鋁柱凈化、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定的方法，但是該方法中氧化鋁的活度控制是技術難點，不易掌握，實際檢測中樣品測定結果的重復性不理想。

凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）常用于高脂肪樣品的目標物凈化[7]。GPC能很好地去除樣品基質中可能干擾目標化合物的油脂、色素、生物堿、聚合物等高分子化合物[8]。GPC的應用已經比較普遍，在糙米、果蔬、大豆中農藥殘留量的測定[9-12]，食品中抗氧化劑、鄰苯二甲酸酯的測定[13-14]等國標方法中已經將GPC作為前處理的主要方法之一。隨著全自動GPC儀的快速發展，徐明雅等[15]報道了凝膠色譜-高效液相色譜法檢測BaP的方法，對GPC的色譜條件和樣品濃縮方法進行了摸索，但缺乏對陽性樣品、復雜樣品的檢測報道。馬君剛[16]、諸葛慶[17]等也報道了凝膠色譜-高效液相色譜-熒光檢測法的檢測方法，方法回收率高，準確性好，但是對檢測不同等級、不同種類油脂的適用情況和對GPC在處理多批樣品后是否長效穩定、與國標方法的優化銜接等沒有深入報道。本實驗在GB/T 22509—2008基礎上，對前處理過程進行改進，以全自動GPC儀代替氧化鋁層析柱進行凈化，省去氧化鋁活度調整和手工填裝柱子的麻煩，使得前處理自動化程度提高，同時對色譜條件進行優化，用C18柱代替多環芳烴檢測專用柱，建立GPC-HPLC方法測定食用植物油中BaP，以期為國標方法的修訂提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用植物油（三級浸出大豆油、四級壓榨菜籽油、一級壓榨菜籽油、一級壓榨山茶油、香油二級芝麻油、初榨橄欖油等） 市售；BaP標準溶液（5.25 μg/mL，相對不確定度2.6%，k=2） 中國計量科學研究院；乙酸乙酯-環己烷（1∶1，V/V）、乙腈（均為色譜純）德國CNW公司。

1.2 儀器與設備

Vario全自動凝膠凈化系統（GPC柱規格：700 mm×25 mm，填料：Bio. Beads S-X3） 德國LC Tech公司；SENCO R-201旋轉蒸發儀（配有250 mL梨形燒瓶） 上海申順生物科技有限公司；e2695高效液相色譜儀（配有2475熒光檢測器、Empower軟件） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

BaP加標使用溶液：將質量濃度為5.25 μg/mL BaP標準溶液用乙酸乙酯-環己烷（1∶1，V/V）逐級稀釋至21.00 ng/mL。

BaP標準曲線系列溶液：將質量濃度為5.25 μg/mL BaP標準溶液用乙腈逐級稀釋得到質量濃度0.21、0.42、0.84、2.10、4.20、10.50、21.00、52.50 ng/mL。

1.3.2 樣品GPC凈化[15]

準確稱取食用植物油樣品約2 g（精確到0.1mg）到10.0 mL具塞刻度試管中，乙酸乙酯-環己烷溶解并定容至10.0 mL。充分混勻后經0.45 μm微孔過濾膜過濾至GPC樣品瓶中，待GPC凈化。

GPC條件：樣品吸取量：5 000 μL；流動相：乙酸乙酯-環己烷（1∶1，V/V）；流速：5.0 mL/min；預運行時間1 560 s，主運行時間1 320 s，尾洗時間720 s，系統沖洗3 次。

1.3.3 樣品濃縮[15]

真空旋轉蒸發：將GPC收集液轉移到250 mL梨形燒瓶中，水浴溫度35 ℃，真空度0.09 MPa條件下旋轉蒸發至近干，氮吹至干，準確移取1.0 mL乙腈至梨形燒瓶中，充分溶解后將樣品轉移到2 mL樣品瓶中，待HPLC分析。

1.3.4 HPLC條件

Waters SunFireTMC18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈-水為88∶12（V/V）；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；激發波長384 nm，發射波長406 nm。

1.3.5 方法長效穩定性考察

考察GPC處理系統經過長時間、多樣品處理后是否保持穩定，2011—2013年期間，對含BaP 11 μg/kg的芝麻油樣品（4 ℃冷藏）進行跟蹤檢測，隔3 個月測定1 次，共測定10 次，每次測定平行測定3 次。每次測定時同時制備BaP 10 μg/kg的加標樣品作為質量控制（quality control，QC）樣品同時檢測，QC樣品回收率在98%～104%范圍內認為質控通過，測定結果可靠。依據色譜圖中雜峰情況和測定結果考察本方法長效穩定性。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的改進

2.1.1 凈化方法

GB/T 22509—2008[5]前處理采用氧化鋁柱，方法中規定2 次獨立測試結果的絕對差值不能超過重復性限r=0.0843m＋0.313和再現性限R=0.100m＋0.256的要求（式中，m為兩次測定結果的算術平均值），而日常檢驗工作中經常出現平行雙試樣測定結果超出該要求，需要重新測定的情況，比如雙試樣測定結果為5.6、6.5 μg/kg，絕對差值為0.9μg/kg，大于重復性限r（r=0.82），不滿足重復性限要求。原因主要在于：1）油脂和BaP之間的分離平衡對氧化鋁活性非常敏感，而活度又很難控制；2）不同品牌不同批次氧化鋁活性存在差異；3）環境因素特別是空氣中水分影響氧化鋁活性；4）方法中提供的氧化鋁活度測試方法，本身有一定的誤差；5）氧化鋁吸附能力有限，處理的樣品量有限；6）柱子填充效果對雜質和目標物流出曲線有影響。基于上述原因，不僅需要通過反復測定質控樣品——調整水的添加量來確認合適的氧化鋁活性，而且需要穩定的柱子填充技藝，要求高、操作繁瑣。

楊琳等[18]報道了采用乙腈飽和正己烷液-液提取的方法進行前處理，吳海智等[19]則采用四氫呋喃-乙腈溶解定容后直接測定，雖然簡便，但是檢出限高，干擾雜質多，對高效液相系統特別是色譜柱的污染和損傷嚴重。另外，吳敏[20]、Dost[21]、胡浩軍[22]等報道的固相萃取前處理中都需要對油脂進行皂化，步驟繁瑣，王紅青[23]、戴啟鳳[24]、文君[25]等報道的固相萃取方法樣品處理量小，僅為0.3 g油脂。實驗中發現：由于固相萃取柱柱容量小，對未經精煉和精煉程度低的三級、四級菜籽油、芝麻油等復雜基質樣品的凈化能力有限，固相萃取處理后的樣品液濃縮后有黃褐色油狀物殘留。

全自動GPC處理系統，其原理為分子空間排阻，油脂分子和BaP分子大小差距大，可以有效分離，凝膠分子對BaP理論上不存在吸附，使得洗脫簡單，即使BaP含量高，也容易恢復到初始柱效，柱子可重復使用。本實驗采用的GPC處理系統樣品處理量可以達到1 g油脂，由于上樣體積和流速控制精準，方法的精密度和重復性高。圖1是四級壓榨菜籽油樣品經GPC凈化、濃縮和測定的色譜圖，測定值為12.6 μg/kg。由圖1可見，GPC前處理對于精煉程度低、色澤深、基質復雜的初級壓榨植物油樣品也可以去除油脂基質干擾，有效凈化，方法可行。

圖 1 四級菜籽油BaP陽性樣品色譜圖Fig.1 Chromatography of BaP positive sample

2.1.2 濃縮和定容方法

以真空旋轉蒸發代替旋轉蒸發，溫度由GB/T 22509—2008的65 ℃降低為35 ℃，而且蒸發速度加快、時間縮短。一步濃縮至近干，氮吹至干后，直接以1.0 mL乙腈而不是100 μL乙腈-四氫呋喃混合試劑溶解樣品。目的是通過增加定容溶劑體積的方法代替反復洗滌、濃縮、定容的步驟，并且只需普通2 mL樣品瓶，不需要特殊樣品瓶。僅乙腈就可以滿足測試要求，不需要特別引入四氫呋喃，避免了國標法的麻煩。

2.2 HPLC色譜條件的改進

GB/T 22509—2008采用25 cm多環芳烴色譜柱長柱作為HPLC分析柱，本實驗中采用15 cm C18短柱作為分析柱，由圖1可以看出，雜質和BaP目標峰有效分離，說明15 cm C18短柱可以滿足檢測要求，如果不具備多環芳烴色譜柱，可以采用實驗室普遍配備的C18柱代替，省去添置的麻煩。其余色譜條件，不需做更改。

2.3 線性范圍和檢出限

BaP標準溶液系列，按法進樣分析，結果表明BaP在0.21～52.50 ng/mL范圍呈現良好的線性，以溶液中BaP的質量濃度X（ng/mL）對峰面積Y進行線性回歸，線性回歸方程為Y=1.27×106X＋1.47×104，相關系數R為0.999 9，靈敏度高、線性好、范圍寬。

采用在空白基質中添加BaP標準溶液的方法，以RSN為3計算出的檢出限為0.2 μg/kg，以RSN為10計算出的最低定量限為0.7 μg/kg。

2.4 回收率和精密度

取不含BaP的三級大豆油、四級菜籽油、一級菜籽油、一級山茶油、芝麻油、橄欖油樣品各一個，準確稱取各樣品（1.680 0±0.000 2）g于10 mL容量瓶中，然后準確加入一定量的BaP加標使用溶液，用乙酸乙酯-環己烷（1∶1，V/V）溶液定容至刻度，充分混勻后經0.45 μm微孔過濾膜過濾至GPC樣品瓶中，配成低、中、高3 個水平的QC樣品，每一平行測定6 次（表1）。結果表明，樣品中低、中、高3 個水平的添加均具有較好的精密度與準確度，回收率在98.6%～103.5%之間，相對標準偏差在2.98%～4.69%之間，不受植物油的品種、等級、工藝的影響。雖然上述BaP標準溶液添加到油脂樣品中進行加標回收考察時，結果理想，但是將BaP標準溶液直接按GPCHPLC法進行加標回收考察，回收率僅為14.2%，說明樣品基質效應非常顯著。因此，進行GPC流出曲線考察時必須將標準溶液添加到植物油樣品中，否則得到的流出時間不能和實際樣品匹配。

表 1 加標回收率和精密度（x±s，n=6）Table 1 Spiked recoveries and RSDs (x± s,, n=6))

2.5 方法長效穩定性

表 2 陽性樣品跟蹤檢測結果（x±s）Table 2 Results of repeated determinations of the same BaP positive sample (ple (x± s)

跟蹤檢測含BaP的芝麻油樣品期間，該GPC系統共處理植物油樣品1 451 批次。10 次檢測中，圖譜重復性較好，雜質峰集中在4 min前，熒光響應強度穩定在30以內，QC樣品回收率在98%～104%范圍內，表2是10 次跟蹤檢測結果。結果表明，10 次測定結果在10.56～11.28 μg/kg之間，平均值為（10.94±0.23） μg/kg，相對標準偏差為2.12%。可見：GPC系統處理多樣品后保持穩定，GPCHPLC方法長效穩定，同時說明冷藏條件下芝麻油中BaP質量分數穩定。

3 結 論

本實驗對GB/T 22509—2008進行改進，建立了GPCHPLC法測定食用植物油中BaP含量的方法，并進行了加標回收考察和陽性樣品跟蹤檢測。結果表明：該方法操作簡單，能有效去除油脂基質干擾，準確度高，重復性好，是一種靈敏度高、線性范圍寬，樣品適應性強，高效穩定的檢測方法，前處理過程較GB/T 22509—2008自動化程度提高，過程簡化，在批量食用植物油樣品中BaP的測定時效率提高。

[1] LUTTRELL W E, THOMAS C J, Toxic tips: benzo(a)pyrene[J]. Journal of Chemical Health and Safety, 2007, 14: 21-22.

[2] MAKAROV V I, SAMSONOV Y N, KOROLEV V V, et al. Contents of 3,4-benzo(a)pyrene and dibutyl phthalate in background atmospheric aerosols in west Siberia, and in wind drifted aerosol exhaust out of the chimneys of heat power station[J]. Journal of Aerosol Science, 1996, 27(Suppl 1): 119-120.

[3] 李雋晹, 巴乾, 黃超, 等. 苯并(a)芘的健康危害及作用機制研究進展[J].中華預防醫學雜志, 2014(2): 154-156.

[4] 衛生部. GB 2762—2012 食品中污染物限量[S]. 北京: 中國標準出版社, 2012.

[5] 遼寧省衛生防疫站. GB/T 5009.27—2003 食品中苯并(a)芘的測定[S].北京: 中國標準出版社, 2003.

[6] 董廣彬, 鄭順利, 王春燕, 等. GB/T 22509—2008 動植物油脂: 苯并(a)芘的測定: 反相高效液相色譜法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[7] FONTCUBERTA M, ARQUéS J, VILLALBí J R, et a1. Chlorinated organic pesticides in marketed food: Barcelona, 2001-06[J]. Science of the Total Environment, 2008, 389(1): 52-57.

[8] MUKHERJEE I, GOPAL M. Chromatographic techniques in the analysis of organochlorine pesticide residues[J]. Journal of Chromatography A, 1996, 754(1/2): 33-42.

[9] 沈崇鈺, 儲曉剛, 徐錦忠, 等. GB/T 5009.207—2008 糙米中50 種有機磷農藥殘留量的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[10] 牟峻, 王明泰, 鄒明強, 等. GB/T 5009.218—2008 水果和蔬菜中多種農藥殘留量的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[11] 陳冬東, 祁彥, 張新忠, 等. GB/T 23816—2009 大豆中三嗪類除草劑殘留量的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2009.

[12] 李曉娟, 祁彥, 張新忠, 等. GB/T 23818—2009 大豆中咪唑啉酮類除草劑殘留量的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2009.

[13] 穆同娜, 許華, 趙玉琪, 等. GB/T 23373—2009 食品中抗氧化劑丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)與特丁基對苯二酚(TBHQ)的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2009.

[14] 常宇文, 李偉, 周相娟, 等. GB/T 21911—2008 食品中鄰苯二甲酸酯的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[15] 徐明雅, 潘丹杰, 夏必坤. 凝膠滲透色譜-高效液相色譜法測定食用植物油中苯并(a)芘含量的研究[J]. 理化檢驗: 化學分冊, 2011, 47(增刊1): 172-173; 177.

[16] 馬君剛, 張煌濤, 于紅, 等. GPC-HPLC-FLD法測定動植物油脂中的苯并(a)芘[J]. 食品科學, 2012, 33(10): 278-281.

[17] 諸葛慶, 葛樂勇, 曾紅燕, 等. GPC-HPLC-FLD法檢測食用植物油中的苯并(a)芘[J]. 食品科技, 2013, 38(8): 294-297.

[18] 楊琳, 陳青俊, 歐菊芳, 等. 高效液相色譜法快速測定植物油中苯并(a)芘含量[J]. 糧食與油脂, 2012(7): 34-36.

[19] 吳海智, 周叢, 袁列江, 等. 高效液相色譜法快速測定植物油中苯并芘的研究[J]. 安徽農業科學, 2011, 39(10): 6075-6076.

[20] 吳敏, 李政, 黎翠玉, 等. 固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測法聯合測定食品中苯并(a)芘[J]. 食品安全質量檢測學報, 2012, 3(2): 82-88.

[21] DOST K, IDELI C. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in edible oils and barbecued food by HPLC/UV-Vis detection[J]. Food Chemistry, 2012, 133(1): 193-199.

[22] 胡浩軍, 侯逸眾, 黃方取. 固相萃取-氣相色譜-質譜法測定植物油中苯并(a)芘和苯并(e)芘[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2014, 24(1l): 1570-1572.

[23] 王紅青, 韓里明, 屠海云, 等. 固相萃取-超高效液相色譜熒光法測定植物油中苯并(a)芘[J]. 食品科學, 2012, 33(14): 216-218.

[24] 戴啟鳳, 徐敏. 反相高效液相色譜法測定芝麻油中苯并(a)芘[J]. 科技創新導報, 2014(11): 102-103.

[25] 文君, 孫丹紅, 王希希. 高效液相色譜法測定植物油中苯并(a)芘[J].預防醫學情報雜志, 2013, 29(12): 1074-1077.

Determination of Benzo(a) Pyrene in Edible Vegetable Oils by Gel Permeation Chromatography

XU Mingya1, PAN Danjie1, JIN Micong2
(1. Hangzhou Grain and Oil Central Inspection Station, Hangzhou 310009, China； 2. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Health Risk Appraisal for Trace Toxic Chemicals, Ningbo Municipal Center for Disease Control and Prevention, Ningbo 315010, China)

A gel permeation chromatography (GPC) method for sample clean-up, followed by high performance liquid chromatography (HPLC) with fl uorescence detection was developed for the determination of benzo(a)pyrene (BaP) in edible vegetable oils. The samples were cleaned up by GPC, evaporated under vacuum atmosphere and then determined by HPLC. The results showed this method was sensitive and had a good linearity within the concentration range of 0.21–52.50 ng/mL. The limit of detection was 0.2 μg/kg and the limit of quantization was 0.7 μg/kg. The mean recoveries of standard additions in different kinds and grades of edible vegetable oils were between 98.6% and 103.5%, with relative standard deviations (RSDs) (n = 6) in the range of 2.98%–4.69%. The average of ten repeated determinations of BaP in one positive sample during the years 2011 to 2013 was 10.94 μg/kg with a RSD of 2.12%, suggesting good repeatability of this method. This GPC-HPLC method is simple, sensitive and reliable for the determination of benzo(a)pyrene in edible vegetable oils.

gel permeation chromatography (GPC); high performance liquid chromatography (HPLC); edible vegetable oil; benzo(a)pyrene

O657.7

A

1002-6630（2015）08-0240-04

10.7506/spkx1002-6630-201508045

2014-07-02

徐明雅（1982—），女，工程師，碩士，研究方向為糧油及制品的檢測。E-mail：2528491555@qq.com