銀合歡果皮總黃酮含量測定及抗氧化活性

楊靜毅，喻玲玲,2,*，吳 梅，劉紀成，張雨杰，江 凱，王 畢

銀合歡果皮總黃酮含量測定及抗氧化活性

楊靜毅1，喻玲玲1,2,*，吳 梅1，劉紀成1，張雨杰1，江 凱1，王 畢1

（1.三峽大學醫學院，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學 天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002）

目的：建立測定銀合歡果皮中總黃酮含量的方法，研究其體外抗氧化活性。方法：運用NaNO2-Al(NO3)3顯色法，檢測總黃酮含量，并采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法和還原力分析其抗氧化活性。結果：蘆丁在0.01～0.05 mg/mL（r=0.999 1）質量濃度范圍內，吸光度與質量濃度之間呈良好線性關系，平均回收率為99.35%（相對標準偏差為1.37%），總黃酮含量為1.76 mg/g；銀合歡果皮具有顯著的抗氧化活性，且呈劑量依賴性，其抑制DPPH自由基的半數抑制濃度（IC50）為0.32 mg/mL，還原力IC50為70.12 μg/mL。結論：所建立的方法簡單快捷、準確、靈敏、重復性好，適合銀合歡果皮中總黃酮含量的測定。銀合歡果皮中含有豐富的黃酮類化合物，且具有良好的體外抗氧化活性。

銀合歡果皮；黃酮；抗氧化活性

銀合歡（Leucaena leucocephala (Lam.) de Wait）又名白合歡，為多年生豆科木本植物，廣泛分布于熱帶亞熱帶地區，在我國南部分布很廣[1]。銀合歡生長快，適應性強，是荒山綠化的先鋒樹種。葉片干物質中粗蛋白質含量達22%～29%，還含有豐富的氨基酸、胡蘿卜素、多種維生素和微量元素，其枝葉和豆莢都是牛、羊的好飼料，被聯合國糧農組織的飼料專家譽為“蛋白質倉庫”[2]。銀合歡葉具有清熱解毒、消食解渴開胃的功效，在海南及廣西民間，銀合歡葉可作為保健茶泡飲，其保健作用與茶葉相當，并且不含咖啡因[3]。

文獻調研發現，銀合歡葉和種子中主要含有黃酮、生物堿、萜類、香豆素、甾體和脂肪酸類化合物[4-14]。在廣西壯族民間銀合歡種子可用于治療糖尿病[15]，現代藥理實驗亦發現銀合歡種子和葉均具有顯著的降血糖、保肝、抑菌、利尿等活性，且其主要的有效成分為黃酮[16-24]。黃酮是具有較強清除自由基和抗氧化能力的一種物質，而黃酮因其結構不同以及含量不同，有的表現出生物活性，有的則沒有生物活性[25-27]。姜建輝等[28]測得銀合歡葉中總黃酮含量為2.05%。

綜上所述，目前關于銀合歡的研究大多集中于其葉和種子，而針對其果皮的研究鮮有報道，為更加充分利用銀合歡資源，對其果皮進行化學成分 及藥理活性研究非常有必要。如果能夠對銀合歡果皮進行開發利用，不僅能夠保護環境，還能使資源利用最大化，并產生巨大的經濟效益和社會效益。因此本實驗對銀合歡果皮中總黃酮的含量測定方法和抗氧化活性進行研究，擬建立銀合歡果皮中總黃酮的含量測定方法，同時對其體外抗氧化活性進行探討，為銀合歡果皮的進一步研究與開發提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀合歡果皮采自云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣，經三峽大學生物與制藥學院陳發菊教授鑒定為豆科含羞草亞科銀合歡屬銀合歡的果皮。

蘆丁對照品（批號：161985） 華順生物技術有限公司；其余所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BS210S電子分析天平 北京賽多利斯儀器有限公司；旋轉蒸發儀 日本東京理化有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；DZF-2B真空減壓干燥箱 北京市永光明醫療儀器有限公司；WGL-65B電熱恒溫鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；Infinite M200 PRO酶標儀 瑞士Tecan公司；SZ-93自動雙重水蒸餾器 上海雅榮生化儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制[29-30]

精密稱取在120 ℃條件下減壓干燥至恒質量的蘆丁標準品5.0 mg于50 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得0.1 mg/mL蘆丁對照品溶液。精密取對照品溶液0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL于6 個5 mL容量瓶中，加質量分數5% NaNO2溶液0.15 mL，混勻，放置6 min；加10% Al(NO3)3溶液0.15 mL，搖勻，放置6 min；加4% NaOH溶液2 mL，再加甲醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。用酶標儀于波長510 nm處測定吸光度。

1.3.2 總黃酮含量測定

銀合歡果皮粉末0.046 g，用質量分數95%乙醇溶液超聲提取3 次，每次0.5 h。過濾、濃縮，加入甲醇溶解，制成1 mg/mL供試品溶液。精密取供試品溶液1 mL按1.3.1節方法測定其總黃酮含量。

1.3.3 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法測定抗氧化活性[31-32]

用無水乙醇定容VC，配成1.58 mg/mL的標準溶液，并用乙醇稀釋成系列標準溶液。取60 μL待測液標準溶液，加60 μL 1 mmol/L DPPH乙醇溶液，充分混合，室溫避光靜置30 min，于波長517 nm處測其吸光度（A實驗）。對照組用60 μL無水乙醇代替DPPH溶液（A對照），空白組用60 μL無水乙醇代替樣品（A空白），各組平行測定3 次，按下式計算DPPH自由基清除率。

1.3.4 還原能力的測定[33-34]

準確稱取33 mg銀合歡果皮粉末，用體積分數95%乙醇溶液定容至10 mL，配成3.3 mg/mL的待測液。在1.5 mL Ep管中分別加入不同質量濃度待測液100 μL，加入磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.6）100 μL和質量分數1%鐵氰化鉀溶液100 μL，置于50 ℃水浴中反應20 min，然后加入質量分數10%三氯乙酸溶液100 μL，搖勻。吸取上清液50 μL，在96孔板中加入50 μL蒸餾水和50 μL質量分數0.025%三氯化鐵溶液。VC為對照品，樣品在波長700 nm處測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

按照1.3節方法制備樣品溶液和標準品溶液，在波長300～500 nm范圍內進行波長掃描，樣品溶液和對照品溶液在波長510 nm處均有最大吸收，由此確定檢測波長為510 nm。

2.2 線性范圍

按照1.3.1節所述方法用酶標儀測定不同質量濃度對照品溶液的吸光度。以對照品質量濃度C（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線。回歸方程：A = 6.348C＋0.009 8，r = 0.999 1。結果表明蘆丁在0.01～0.05 mg/mL質量濃度范圍內，吸光度與質量濃度間呈良好線性關系。

2.3 精密度

精密取質量濃度為0.1 mg/mL蘆丁對照品溶液1.00 mL，連續測定5 次，記錄吸光度，其相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.78%，表明精密度良好，結果見表1。

表 1 精密度實驗結果Table 1 Precision of the spectrophotometric method for determination of total flavonoids ds

2.4 穩定性

精密稱取干燥至恒質量的銀合歡果皮粉末0.046 g，按1.3.2節方法制備樣品溶液，室溫條件下放置，分別于0、0.5、1、2、3 h測定吸光度，樣品的吸光度RSD為0.47%，表明樣品溶液在3 h內穩定。實驗結果見表2。

表 2 穩定性實驗結果Table 2 Stability of the spectrophotometric method for determination of total flavonoids ds

2.5 重復性

精密稱取5 份干燥至恒質量的銀合歡果皮粉末，按1.3.2節方法制備樣品溶液，測定其吸光度，樣品的吸光度RSD為1.33%，表明該方法有良好的重復性。實驗結果見表3。

表 3 重復性實驗結果Table 3 Repeatability of the spectrophotometric method for determination of total flavonoids ds

2.6 加樣回收率

精密稱取5 份已知含量（1.76 mg/g）的銀合歡果皮粉末，每份加入蘆丁對照品0.040、0.080、0.120、0.160、0.200 mg，按照1.3.2節方法測定其吸光度，計算回收率，蘆丁的平均回收率為99.35%，RSD為1.37%。結果表明總黃酮回收率良好，方法準確性高，具有可行性，具體結果見表4。

表 4 加樣回收率實驗結果Table 4 Repeatability of the spectrophotometric method forTable 4 Repeatability of the spectrophotometric method for determination of total flavonoids ds

2.7 銀合歡果皮中總黃酮含量

按照1.3.2節方法制備5 份供試品溶液，按1.3.1節方法測定其吸光度，由回歸方程計算含量。5 批銀合歡果皮中總黃酮的平均含量為1.76 mg/g。

2.8 銀合歡果皮的抗氧化能力

對銀合歡果皮清除DPPH自由基的能力進行研究，由圖1可知，銀合歡果皮對DPPH自由基具有顯著的清除作用，其清除能力隨樣品質量濃度增加而增強（半數抑制濃度（half inhibition concentration，IC50）為0.32 mg/mL），但銀合歡果皮清除DPPH自由基的能力弱于陽性對照VC（IC50為0.01 mg/mL）。

圖 1 銀合歡果皮對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical-scavenging capacity of L. leucocephala fruit peel

2.9 銀合歡果皮的還原能力

抗氧化劑的抗氧化能力與其還原力有關，還原力越大，抗氧化能力越強。反應物的吸光度增加表明還原力增強。由圖2可知，隨著質量濃度的增加，樣品的吸光度明顯上升，表明還原能力逐漸增強，呈現較好的量效關系。IC50為70.12 μg/mL的銀合歡果皮提取物的還原力與IC50為7.74 μg/mL的VC相當。

圖 2 銀合歡果皮還原能力Fig.2 Reducing power of L. leucocephala fruit peel

3 結 論

銀合歡作為營養保健型的綠色食品，日益受到人們的關注，其研究和開發也在逐步深入。本實驗運用NaNO2-Al(NO3)3顯色法對銀合歡果皮中總黃酮含量測定進行相關的探索，建立含量測定方法操作合理簡單，方法精密度高，重復性及線性關系良好，回收率高，可為銀合歡的質量控制提供研究基礎。

目前關于銀合歡果皮的藥理活性鮮有報道，本研究探討其體外抗氧化活性，銀合歡果皮清除DPPH自由基的IC50為0.32 mg/mL，還原力的IC50為70.12 μg/mL，表現出較好的體外抗氧化活性。而關于其總黃酮含量與抗氧化活性間的相關性，還有待進一步的研究。

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Antioxidant Activities and Total Flavonoid Content in the Peel of Leucaena leucocephala Fruits

YANG Jingyi1, YU Lingling1,2,*, WU Mei1, LIU Jicheng1, ZHANG Yujie1, JIANG Kai1, WANG Bi1
(1. College of Medical Science, China Three Gorges University, Yichang 443002, China；2. Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development, China Three Gorges University, Yichang 443002, China)

Purpose: To establish a method for the determination of total flavonoids and to evaluate the antioxidant activity of the ethanol extract of Leucaena leucocephala (Lam.) de Wait fruit peel. Methods: The content of total flavonoids was measured by NaNO2-Al(NO3)3assay. The antioxidant property was determined by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging and reducing power assays. Results: The linear range of rutin was 0.01–0.05 mg/mL (r = 0.999 1). The average recovery rate was 99.35% with relative standard deviation (RSD) of 1.37%. The content of total flavonoids was 1.76 mg/g. In DPPH radical scavenging assay, the sample exhibited antioxidant activity in a dose-dependent manner with IC50of 0.32 mg/mL. The IC50for reducing power was 70.12 μg/mL. Conclusions: The developed method is rapid, accu rate, simple, reproducible and suitable for determination of total flavonoids in the fruit peel of L. leucocephala. Moreover, the fruit peel of L. leucocephala is rich in flavonoids and possesses high antioxidant activity.

Leucaena leucocephala (Lam.) de Wait peel； flavonoids； antioxidant activity

R284.1

A

1002-6630（2015）08-0187-04

10.7506/spkx1002-6630-201508034

2014-09-22

湖北省教育廳優秀青年項目（Q20131309）；三峽大學人才啟動基金項目（KJ2011B050）

楊靜毅（1991—），女，本科生，主要從事天然產物質量控制研究。E-mail：429883444@qq.com

*通信作者：喻玲玲（1983—），女，講師，博士，主要從事天然產物研究與利用。E-mail：yulingling@ctgu.edu.cn