基于GC-MS指紋圖譜和化學計量分析鑒別預包裝純葡萄汁及葡萄汁制品

李寶麗，朱宇軒，鄧建玲，譚 軍，劉 睿,*，王 紅，李 濤，周勝銀

基于GC-MS指紋圖譜和化學計量分析鑒別預包裝純葡萄汁及葡萄汁制品

李寶麗1，朱宇軒1，鄧建玲1，譚 軍1，劉 睿1,*，王 紅2，李 濤2，周勝銀2

（1.華中農業大學食品科學技術學院，環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070；2.湖北省產品質量監督檢驗研究院，湖北 武漢 430061）

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術研究預包裝純葡萄汁的香氣成分，建立其香氣成分的氣相色譜-質譜指紋圖譜，結合化學計量分析對3 個產地的混合果汁、純葡萄汁、葡萄汁飲料共3 類預包裝葡萄汁制品進行鑒別。結果表明：預包裝純葡萄汁中主要香氣成分共38 種，所建立香氣成分的氣相色譜-質譜指紋圖譜中共分析出15 個特征峰，其峰面積之和占總峰面積的95%以上。利用夾角余弦法和相關系數法對指紋圖譜進行分析，發現氣相色譜-質譜指紋圖譜相似度與其品質呈正相關。所建立的香氣成分指紋圖譜結合化學計量分析能準確將預包裝混合果汁、葡萄汁飲料和純葡萄汁鑒別區分。

預包裝純葡萄汁；香氣成分；氣相色譜-質譜指紋圖譜；化學計量分析；質量評價

純果汁因其最大限度保有新鮮水果的風味和營養成分，日益受到消費者的歡迎。然而，受利益的驅使，純果汁產品的摻假現象時有報道，如以果汁飲料（果汁含量不小于10%）和混有其他低價果汁的產品冒充純果汁，嚴重侵害了消費者的權益[1]。純葡萄汁有“液體水果”之稱，其營養豐富、甜酸適口、色澤艷麗，在純果汁市場中倍受推崇。純葡萄汁中香氣物質的種類和含量對其品質有重要影響，研究純葡萄汁中的香氣物質對預包裝純葡萄汁的質量監控、甚至產品營銷皆有重要意義。

葡萄漿果中的芳香成分與葡萄制品的典型風味特征密切相關，早期研究集中在葡萄果實和葡萄酒香氣成分分析等方面[2-6]，近年來，葡萄制品香氣質量及其評價模型的構建逐漸成為新的研究熱點[7-10]。指紋圖譜技術被廣泛應用于這一研究領域[11-15]，對成分較復雜的果汁質量控制而言，果汁指紋圖譜因具有系統性、特征性和重復性，能展現出果汁質量控制標準的整體性與模糊性，又因其數據分析結果的科學性而逐漸受到國際上的認可[15-16]。指紋圖譜的數據解析大都比較復雜，根據需要解決問題的類型和數據類型以及規模不同，通常采用不同分析方法加以解析，相似度評價因能客觀數字化描述指紋圖譜間的相似性被廣泛采用，最常用的是相關系數法和夾角余弦法[17-20]。相關系數法主要測定樣品間在特征變量的變化模式上相似形狀的相似度，可通過計算出定性信息的相似度來鑒別樣品真偽情況。夾角余弦是基于多維空間向量夾角上，計算樣品指紋圖譜特征向量與共有模式向量之間的相似度[21-25]。

目前僅有少量文獻報道了自制葡萄汁的香氣質量及其評價模型的研究，而對預包裝純葡萄汁香氣物質氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）指紋圖譜的建立及質量判別研究，國內外還未見文獻報道。本研究采用頂空固相微萃取-GC-MS（solid phase micro-extraction-GC-MS，SPME-GCMS）聯用技術對40 批預包裝純葡萄汁的香氣成分進行分析，在明晰其中主要香氣物質的基礎上，建立預包裝純葡萄汁香氣物質的GC-MS指紋圖譜，并對市場上不同種類預包裝葡萄汁產品進行識別，研究結果為我國預包裝純葡萄汁的真偽鑒別和質量評價提供了研究思路和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

預包裝純葡萄汁樣品：共3 個產地40 個批次，產地分別為北京順義、江蘇鹽城和山東萊蕪，生產時間是2013年7月—2014年5月，產品規格為250 mL利樂包。

3 類市售預包裝葡萄汁制品分別為：市售預包裝100%蘋果葡萄汁（混合果汁），產地為河北衡水；市售預包裝每日C紅葡萄（飲料，果汁含量≥10%），產地為湖北武漢；市售預包裝葡萄多（飲料，果汁含量≥10%），產地為湖北武漢；市售預包裝葡萄汁（純果汁），產地為河北衡水；市售預包裝紅葡萄（純果汁），產地為深圳。以上3 類市售預包裝純葡萄汁制品均購買于武商量販和武漢麥德龍超市。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C GC-MS聯用儀、HP-5MS彈性石英毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm） 美國Agilent公司；SPME裝置、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/ CAR/PDMS）萃取頭、15 mL頂空鉗口樣品瓶 美國Supelco公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 武漢科爾儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME提取預包裝純葡萄汁香氣成分

準確量取預包裝純葡萄汁6 mL移入15 mL頂空瓶中，加入磁力攪拌子，用硅橡膠隔墊密封，于50 ℃恒溫磁力攪拌器上加熱平衡15 min后，使用50/30 μm DVB/ CAR/PDMS 3 層復合萃取頭頂空吸附50 min，然后將萃取頭插入GC進樣口，解吸5 min。

1.3.2 GC-MS分析

色譜條件：HP-5MS石英毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持2 min，然后以3 ℃/min的升溫速率升至130 ℃，保持3 min，再以12 ℃/min的升溫速率升至250 ℃；載氣（He）流速l mL/min；進樣口溫度250 ℃；脈沖無分流進樣。

質譜條件：電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子電離源；質量掃描范圍m/z 40～450；全掃描。

1.4 數據處理

GC-MS實驗數據由計算機檢索并與圖譜庫（NIST 11和Wiley）的標準質譜圖對照進行分析，再結合相關文獻進行人工譜圖解析，確認預包裝純葡萄汁中香氣物質的化學結構和名稱，其相對含量采用峰面積歸一化法分析；GC-MS指紋圖譜采用Origin 75軟件建立。根據40 個批次樣品的GC-MS指紋圖譜、離子峰的相對保留時間和相對峰面積找到共有峰，采用SPSS 17.0軟件進行相似度分析[26]。

2 結果與分析

2.1 預包裝純葡萄汁GC-MS分析方法評價

圖 1 預包裝純葡萄汁香氣成分GC-MS總離子圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of aroma components in prepackaged pure grape juice

采用本研究所建立的SPME-GC-MS方法對預包裝純葡萄汁樣品進行分析。由圖1可知，色譜峰數量多，較均勻分布在0～45 min時間段，并且豐度較高，說明SPME以及GC-MS條件合適，為了準確評價該方法的可行性，進行方法學考察。

2.1.1 精密度

取同一批次預包裝純葡萄汁樣品，采用本研究所建立的GC-MS方法，連續進樣6 次，以鄰氨基苯甲酸甲酯色譜峰為參照峰（S峰），計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積，測得各共有峰相對峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）小于0.66%，各共有峰相對保留時間RSD小于0.97%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 重復性

取6 個批次的預包裝純葡萄汁樣品6 份，采用本研究所建立的GC-MS方法，以鄰氨基苯甲酸甲酯色譜峰為參照峰（S峰），計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積，測得各共有峰相對峰面積RSD小于0.82%，各共有峰相對保留時間RSD小于0.92%，表明建立的實驗方法重復性良好。

2.1.3 穩定性

取同一預包裝純葡萄汁樣品，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，以鄰氨基苯甲酸甲酯色譜峰為參照峰（S峰），計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積，測得各共有峰相對峰面積RSD小于0.70%，各共有峰相對保留時間RSD小于0.96%，表明供試樣品在24 h內穩定，達到指紋圖譜分析要求。

由以上結果可知，所建立的SPME-GC-MS分析方法的精密度高、穩定性和重復性好，所得到的預包裝純葡萄汁香氣成分的GC-MS色譜圖可用于純葡萄汁香氣成分指紋圖譜的構建。GC-MS分析結果經NIST 11.LIB譜庫進行自動檢索，并結合相關文獻，可確定預包裝純葡萄汁中的香氣成分。

2.2 預包裝純葡萄汁中香氣成分的GC-MS分析與鑒定

對不同生產日期的40 批3 個產地的預包裝純葡萄汁進行GC-MS分析，共鑒定出176 種香氣成分。通過比較發現，40 批預包裝純葡萄汁中共有的主要香氣物質有38 種，見表1。

由表1可知，預包裝純葡萄汁中香氣成分類型包括酯類、醇類、醛類、酸類、酮類、烯類、烷類及苯環類，其中以酯類、醛類、烷類和醇類為主。相對含量較高的成分有：鄰氨基苯甲酸甲酯（96.89%）、丙酸乙酯（70.10%）、α-甲基苯甲基乙酸酯（66.28%）、丁酸乙酯（58.62%）、2,6-二甲基-2,6-辛二烯（17.44%）、庚酸乙酯（16.14%）、糠醛（13.11%）、乙酸順式-3-己烯酯（7.33%）、二丁基羥基甲苯（4.34%）、苯乙醛（3.11%）、二十烷（2.38%）、苯甲醛（2.05%）等。

表 1 SPME-GC-MS鑒定的40 批預包裝純葡萄汁主要香氣成分及相對含量Table 1 The main aroma compounds and their relative contents in forty batches of prepackaged grape juices identified by SPME-GC-MS

2.3 預包裝純葡萄汁GC-MS指紋圖譜的建立

建立指紋圖譜的關鍵在于找到穩定的特征峰和參照峰，特征峰根據色譜圖和色譜峰的保留時間確定，參照峰一般選取峰面積較大、相對穩定的峰。通過比較40 個批次預包裝純葡萄汁樣品的色譜圖和色譜峰的保留時間，發現預包裝純葡萄汁共有峰有15 個，可以作為預包裝純葡萄汁指紋圖譜穩定的特征峰，見表2。比較15 個特征峰，發現保留時間為29.54 min峰的峰面積最大且相對穩定，可以作為參照峰，結合GC-MS分析發現此峰對應的化合物為鄰氨基苯甲酸甲酯。將參照峰的保留時間和峰面積皆定為1，分別計算其他特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表3、4。由表3、4可知，特征峰的相對保留時間RSD均小于2%，表明其在GC-MS色譜圖中相對穩定，可作為定性鑒別的指標。

表 2 預包裝純葡萄汁指紋圖譜信息Table 2 The fingerprint data of prepackaged pure grape juice

表 3 預包裝純葡萄汁GC-MS指紋圖譜特征峰的相對保留時間Table 3 The relative retention times of the GC-MS fingerprints of prepackaged pure grape juice ce

續表3

表 4 預包裝純葡萄汁GC-MS指紋圖譜特征峰的相對峰面積Table 4 The relative peak areas of the GC-MS fingerprints of prepackaged pure grape juice ce

將40 批預包裝純葡萄汁的離子色譜圖原始數據導入到Origin 75軟件中，建立預包裝純葡萄汁香氣成分的GC-MS指紋圖譜，見圖2。

圖 2 預包裝純葡萄汁香氣成分的GC-MS指紋圖譜Fig.2 GC-MS fingerprints of aroma components in prepackaged pure grape juice

相似度分析用于客觀數字化的描述指紋圖譜間的相似性，通常采用相關系數法和夾角余弦法。對40 批次預包裝純葡萄汁的色譜圖進行分析，利用15 個特征峰的相對峰面積進行相似度計算，結果見表5。15 個特征峰相似度的相關系數在0.942～0.997之間，夾角余弦的相關系數在0.945～0.998之間，說明40 批預包裝純葡萄汁樣品的相似度極高，能夠準確反映出不同產地與批次預包裝純葡萄汁的共性，可用來建立預包裝純葡萄汁GC-MS指紋圖譜。

表 5 預包裝純葡萄汁樣品的GC-MS指紋圖譜間的相似度Table 5 The similarity of GC-MS fingerprints of prepackaged pure grape juice ice

2.4 不同類型預包裝葡萄汁制品的識別

表 6 預包裝純葡萄汁香氣成分GC-MS指紋圖譜與預包裝葡萄汁制品的相似度比較Table 6 Similarity comparison of aroma components GC-MS fingerprints of prepackaged pure grape juice and prepackaged grape juice products ucts

采用SPME-GC-MS分析3 類預包裝葡萄汁制品中的香氣成分，以2.3節建立的預包裝純葡萄汁指紋圖譜為對照模板，利用軟件SPSS 17.0評價他們的相似度，結果見表6。根據相似度系數可以將5 個市售預包裝葡萄汁制品分為3 類，第1類是編號1的樣品，相似度系數小于0.6；編號2、3樣品為第2類，相似度系數介于0.6～0.9之間；編號4、5樣品為第3類，相似度系數大于0.9。根據相似度系數結果判定4、5號樣品為純葡萄汁，1、2、3號樣品不是純葡萄汁，與檢測樣品本身屬性完全吻合。經GC-MS分析結果可知，5 個樣品皆可以檢測到大部分特征峰，但其相對含量有所不同。其中，僅5號樣品中檢測到了苯乙醛，其他樣品中均未檢測到；4、5號樣品中均檢測到了乙酸己酯，而1、2、3號樣品中均未檢測到；鄰氨基苯甲酸甲酯在4、5號樣品中含量是最高的，達到100%，而在1、2、3號樣品中含量卻很低，分別為20.14%、12.97%、37.86%。此結果表明，本研究建立的預包裝純葡萄汁GC-MS指紋圖譜能很好地鑒別出3 類預包裝葡萄汁制品，進一步驗證所建立的預包裝純葡萄汁指紋圖譜的準確性。

3 結 論

對所建立的預包裝純葡萄汁中香氣成分GC-MS方法進行方法學考察，該方法的精密度高、穩定性和重復性好。并對40 批預包裝純葡萄汁的香氣成分進行分析，共鑒定出176 種香氣成分，其共有的主要香氣物質有38 種。香氣成分類型包括酯類、醇類、醛類、酸類、酮類、烯類、烷類及苯環類，其中以酯類、醛類、烷類和醇類為主。相對含量較高的成分有：鄰氨基苯甲酸甲酯（96.89%）、丙酸乙酯（70.10%）、α-甲基苯甲基乙酸酯（66.28%）、丁酸乙酯（58.62%）、2,6-二甲基-2,6-辛二烯（17.44%）、庚酸乙酯（16.14%）、糠醛（13.11%）、乙酸順式-3-己烯酯（7.33%）、二丁基羥基甲苯（4.34%）、苯乙醛（3.11%）、二十烷（2.38%）、苯甲醛（2.05%）等。

比較了40 個批次預包裝純葡萄汁樣品的色譜圖，結合化學計量學中的相關系數法和夾角余弦法進行分析，確定相對含量穩定的15 個峰為其特征指紋峰，鄰氨基苯甲酸甲酯對應的色譜峰為參照峰，建立純葡萄汁香氣成分GC-MS指紋圖譜。

所建立的預包裝純葡萄汁GC-MS指紋圖譜結合相似度分析，能將市售預包裝純葡萄汁和葡萄汁飲料以及混合果汁3 類葡萄汁制品準確區分。本研究為預包裝純葡萄汁質量控制及進一步研究建立預包裝純葡萄汁摻偽快速鑒別技術提供了科學依據。

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Discrimination of Prepackaged Pure Grape Juice and Its Commercial Products Based on Gas Chromatography-Mass Spectrometry Fingerprints and Chemometrics Methods

LI Baoli1, ZHU Yuxuan1, DENG Jianling1, TAN Jun1, LIU Rui1,*, WANG Hong2, LI Tao2, ZHOU Shengyin2
(1. Key Laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministry of Education, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；2. Hubei Research Institute of Products Quality Supervision and Inspection, Wuhan 430061, China)

The aroma components of prepackaged pure grape juice were investigated and their gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) fingerprints were established by solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS) combined with similarity evaluation for the first time. By utilizing the fingerprinting, the qualities of 3 kinds of commercial grape juice from 3 regions were assessed. The results showed that 38 main aroma components were identified in commercial grape juice, with a total of 15 peaks being detected as the characteristic peaks, and their areas accounted for more than 95% of the total peak area. The GC-MS fingerprints were analyzed by angle cosine and correlation coefficient. It was concluded that a positive correlation was found between the similarity of GC-MS chromatograms and the quality of grape juice. Prepackaged mixed juice, grape juice beverage and pure grape juice could be accurately identified by their aroma components fingerprints. The GC-MS fingerprints of prepackaged pure grape juice can provide a scientific basis for the quality control and authenticity identification of grape juice.

prepackaged pure grape juice； aroma component； gas chromatography-mass spectrometry fingerprints；chemometrics methods； quality evaluation

TS255.44

A

1002-6630（2015）08-0156-06

10.7506/spkx1002-6630-201508028

2014-09-28

國家質檢總局公益性行業科研專項（2012104002-4）

李寶麗（1987—），女，碩士研究生，主要從事天然產物化學與食品安全研究。E-mail：libaoli871028@163.com

*通信作者：劉睿（1969—），男，副教授，博士，主要從事天然產物化學與食品質量安全研究。E-mail：liurui@mail.hzau.edu.cn