兩種方法檢測奶牛結核病的比較分析

翀 ，韓慶安*

(1.中共遷安市委農工委河北遷安064400；2.秦皇島市動物疫病預防控制中心河北秦皇島066001；3.秦皇島市畜牧站河北秦皇島066001；4.鹽山縣動物疫病預防控制中心河北滄州061300；5.河北省動物疫病預防控制中心河北保定071000)

兩種方法檢測奶牛結核病的比較分析

王麗霞1，李愛華2，王會杰3，劉翠梅4，劉天駒5，李翀5，韓慶安5*

(1.中共遷安市委農工委河北遷安064400；2.秦皇島市動物疫病預防控制中心河北秦皇島066001；3.秦皇島市畜牧站河北秦皇島066001；4.鹽山縣動物疫病預防控制中心河北滄州061300；5.河北省動物疫病預防控制中心河北保定071000)

采用常規皮內變態反應(TST方法)對唐山、秦皇島、滄州和石家莊四個市共計2 204頭奶牛進行牛結核病檢測，采用IFN-γ試驗方法對PPD檢測結果為陽性、可疑的牛以及部分陰性牛進行復檢。將IFN-γ試驗與TST檢測結果相比較，其敏感性為78.26%，特異性為89.09%，符合率為84.33%。研究表明單獨使用PPD皮內變態反應方法在牛結核病的診斷方面存在特異性差的缺點，用IFN-γ試驗對TST試驗陽性和可疑牛進行復檢可以提高特異性，避免造成假陽性牛的誤殺；該方法在臨床上適合推廣應用。

奶牛結核病;皮內變態反應;IFN-γ試驗

牛結核病(Bovine Tuberculosis)是由分支桿菌屬牛分枝桿菌所引起的一種慢性消耗性傳染病，由于該病也感染人，所以是人畜共患病。該病雖然能夠感染豬、鹿、猴等動物，但牛最易感；而在牛中，黃牛和牦牛感染級別較大，水牛易感性較高，但奶牛最易感染[1]。我國將該病列為二類動物疫病，而OIE將其列為需通報的B類動物疫病[2]。當前，人民對牛奶和牛肉的需求量較大，我國奶牛業發展較快，但通過對人結核病患者病原統計分析，有10%結核病病原為牛分枝桿菌[3,4]，故該病控制的好壞，直接關系到奶牛養殖業的發展和居民的身體健康，因此及時檢測、淘汰結核感染的奶牛具有重要的現實意義。

牛全血干擾素試驗方法（牛IFN-γ試驗方法）是牛結核診斷的一種新型的牛結核診斷方法，由Wood等首先將該方法用于牛結核病的檢測[5]，而澳大利亞利采用該方法作為牛結核病根除計劃的首選試驗方法運用于臨床，效果顯著，并于1997年底宣布消滅了牛結核病[6]。當前，該方法在歐盟和美國等發達國家也得到了承認，成為繼TET方法之外的唯一的法定活畜牛結核病診斷試驗。當前我國主要采用頸部皮試變態反應（TST法）來進行牛結核病的檢疫，對陽性牛進行撲殺，對可疑牛隔離后再次進行檢疫，而國外采用的用于牛結核病檢疫的牛IFN-γ試驗方法目前在我國尚未正式推薦使用。由于TST法存在非特異性強、假陽性率高的特點，加之我國對撲殺奶牛經濟補償價偏低，這給基層動物疫控系統嚴格執行牛結核病的檢疫、撲殺政策帶來了了巨大的阻力。即要做到不提高檢測成本，又要做到降低其檢測結果的非特異性，是當前在牛結核的檢疫中亟需解決的問題。本研究引入IFN-γ試驗法，并同TST法的試驗結果進行比較分析，來探討分析其在實際工作中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

奶牛來自唐山市、秦皇島市、滄州市和石家莊市的奶牛場，總共2 204頭（四個市分別為937頭、356頭、398頭和513頭）。

1.2 主要試劑

BOVIGAM?牛結核分枝桿菌γ-干擾素檢測試劑盒，購自Prionics AG公司（批號：6339900101）；牛型PPD（牛型提純結核菌素)，購自哈藥集團生物疫苗有限公司（批號：201304）。

1.3 方法

1.3.1 TST試驗和IFN-γ試驗按照說明書規定的方法進行。

1.3.2 2種方法的符合率、敏感性和特異性比較按照如下公式計算：

符合率=（真陽性數+真陰性數）/被檢總數、敏感性=真陽性數/（真陽性數+假陰性數）、特異性=真陰性數/（真陰性數+假陽性數)。

2 結果

2.1 TST試驗

TST試驗結果見表1。

表1 TST試驗結果

2.2 IFN-γ試驗

IFN-γ試驗結果見表2。

表2 IFN-γ試驗結果

2.3 符合率、敏感性和特異性比較

符合率、敏感性和特異性比較結果見表3。

表3 IFN-γ試驗和TST試驗檢測符合率情況比較

3 分析與討論

本研究中對TST試驗方法檢出的60頭結核病陽性牛進行IFN-γ試驗方法檢測，檢出牛型結核36頭、禽型結核牛6頭；對TST試驗方法檢出的121頭可疑牛進行IFN-γ試驗方法檢測，檢出牛型結核10頭、禽型結核牛13頭。從檢測數據可以看出，部分皮內變態反應陽性牛呈現出假陽性結果，若單獨用該方法檢出的PPD陽性牛實行撲殺策略，勢必誤殺部分假陽性牛。而對于皮內變態反應可疑的牛，需要在60 d后進行復檢，仍為可疑的，需要再過60 d再次進行復檢，這無疑造成了病原的擴散和疫情處置的延誤。我們對TST發檢出的36頭陰性牛進行IFN-γ檢測，結果全部陰性；而徐賢坤（2010）等對 PPD檢出的25頭陰性牛進行IFN-γ檢測，結果檢出了5頭假陰性牛，與我們的結果不相符，這可能與檢測的數量多少和選擇針對性樣品不同有關[7]。

對217份奶牛樣本進行牛結核病IFN-γ試驗和TST試驗比較，結果其敏感性、特異性和符合率分別為78.26%、89.09%和84.33%，而徐賢坤（2010）等檢測的結果分別為53.33%、70.49%和67.11%[7]；朱冬冬（2010）等[6]檢測結果分別為30.30%、82.05%和39.56%，我們的結果均比他們的高。

資料顯示，對TST試驗后2～28 d內的奶牛采樣進行IFN-γ試驗檢測，其敏感性和特異性不受影響。但我們對牛群進行TST檢測后40 d、28 d、14 d和3 d的樣品進行IFN-γ試驗結果表明，兩種方法檢測間隔越短，其陽性符合率越高，出現的假陽性或假陰性越少。雖然在牛結核檢疫中可以不進行TST試驗方法檢測，直接進行IFN-γ試驗檢測，但其高昂的價格（160元/份）和繁瑣的試驗過程，不適合在我國基層進行大面積推廣。我們認為，在對奶牛進行TST試驗后3～5 d，對檢測出的陽性及可疑牛采樣進行IFN-γ試驗檢測是比較理想的。這樣不僅降低檢疫成本，還可以避免誤殺部分假陽性牛。

由于存在遲發型變態反應現象，試驗TST檢測中，對72 h呈現可疑的奶牛一定要觀察到96 h或120 h，否則會出現陽性牛漏檢現象。我們在對滄州市的奶牛進行TST檢測時，有一頭奶牛在72 h時皮厚差為1.18 mm，到96 h時皮厚差為2.56 mm。對該奶牛采樣進行IFN-γ試驗檢測，結果牛結核陽性。

國內部分學者對牛結核的其他檢測方法也進行比較分析。張喜悅（2010）等認為γ-干擾素試驗和國外比較變態反應之間具有較好的陽性符合率，國內牛PPD與國外牛PPD試驗結果相似，但國內常規皮試的特異性很低，而將國內皮試改進為國內比較皮試，則與國外常規的比較皮試具有較好的陽性符合率[8]；金璐娟（2004）等采用變態反應與ELISA同時對奶牛結核病進行檢測，并以剖檢進行驗證，結果表明變態反應陽性并不能全包括ELISA陽性。變態反應與剖檢的符合率為3.14%；而ELISA與剖檢的符合率為75%，ELISA檢測具有較好的特異性[9]。謝志勤（2010）等應用牛結核菌素對廣西奶水牛進行牛結核病皮內變態反應的檢測，然后對皮內變態反應陽性牛采樣進行分離培養、γ-干擾素ELISA和PCR方法檢測，比較這四種檢測方法的符合率，結果表明γ-干擾素ELISA和PCR方法檢測具有較好的特異性，可以作為變態反應檢測的補充[10]。有關該方面的比較分析，有待于我們今后進一步研究。

總之，將PPD的TST試驗方法同IFN-γ檢測方法聯合用于牛結核病的檢疫，將有效提高檢測方法的特異性和準確度，適合在我國推廣應用。█ （編輯：李雨慈）

[1] 蔡寶祥.家畜傳染病學[M].4版.北京:中國農業出版社,2000: 110-114.

[2] World Organization for Animal Health [OIE].Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals〔M〕.Paris,Bovine tuberculosis.2009,16-22.

[3] 張高迪,邢新華,楊醉宇,等.內蒙古哲里木盟人與牛結核相互傳播關系的研究[J].內蒙古畜牧獸醫,1996,2:47-49.

[4] 陳祥,徐正中,時振華,等.γ-干擾素試驗和皮試變態反應對檢測奶牛結核病的比較 [J].中國人獸共患病學報,2011,27(2): 97-100.

[5] Wood PR,Corner LA,Plackett P.Development of a simple,rapid in vitro cellular assay for bovine tuberculosis based on the production of gamma interferon[J].Res Vet Sci 1990,49(1):46-49.

[6] 朱冬冬,孫泉云,曹傳閨,等.牛γ－干擾素EIA與TST檢測牛結核病的比較等.上海畜牧獸醫通訊,2010,(2):14-15.

[7] 徐賢坤,黃小武,藍紀,等.兩種奶牛結核病檢測方法的比較[J].畜牧與獸醫,2010,42(2):29-33.

[8] 張喜悅,呼西旦,楊經緯,等.γ-干擾素試驗及比較皮試在結核污染牛群的應用研究 [J].中國人獸共患病學報,2010,26(1): 53-56.

[9] 金璐娟,劉景霞,王偉,等.兩種方法檢測奶牛結核的比較[J].黑龍江畜牧獸醫,2004,(3):45.

[10] 謝志勤,謝芝勛,劉加波,等.四種方法檢測廣西奶水牛結核病的比較[J].中國動物檢疫,2010,27(11):52-55.

Comparison of Two Methods for Detection of Bovine Tuberculosis

Wang Lixia1,Li Aihua2,Wang Huijie3,Liu Cuimei4,Liu Tianju5,Li Chong5,Han Qingan5*
(1.Rural Work Community of Qian`an City,Qian`an,Hebei,064400; 2.Animal Disease Prevention and Control Center of Qin Huangdao City,Qin Huangdao,Hebei,066001; 3.Animal Husbandry and Veterinary Station of Qin Huangdao City,Qin Huangdao,Hebei,066001; 4.Animal Disease Prevention and Control Center of Yanshan County,Yanshan,Hebei,061300; 5.Animal Disease Prevention and Control Center of Hebei Province,Baoding,Hebei,071000)

A total of 2 204 cows from Tangshan,Qin Huangdao,Cangzhou and Shi Jiazhuang were checked for bovine tuberculosis with the method of tuberculin skin test(TST),of which the positive,doubtful and some negative results were rechecked by γ-interferon assay.The results of γ-interferon assay which has a sensitivity of 78.26%and a specificity of 84.33%were compared to those of TST.According to that,the consistency rate of the two methods reached 84.33%.The study showed that γ-interferon assay,which could improve the specificity and therefore avoid false culling,was suited for widespread clinical use.

bovine tuberculosis;tuberculin skin test;γ-interferon assay

10.3969/j.issn.1008-4754.2015.01.033

*通訊作者：韓慶安，男，博士，主要從事動物疫病防控研究。E-mail：hanqingan2004@sina.com