辣椒素通過調節PLC－γ1信號通路對膽管癌細胞功能的影響

辣椒素通過調節PLC-γ1信號通路對膽管癌細胞功能的影響

江愷

(浙江省人民醫院普外科，浙江杭州310014)

摘要〔〕目的探討辣椒素(CAP)對人膽管癌(CCA)細胞系RBE增殖及凋亡的影響。方法體外培養的RBE細胞采用0、50、100、150、200 μmol/L的CAP及200 μmol/L的CAP處理0、24、48、72 h，用MTT方法和流式細胞儀檢測RBE細胞增殖和凋亡能力的變化，采用Western印跡方法檢測RBE細胞中磷脂酶C(PLC)-γ1信號通路的磷酸化活化情況。采用PLC-γ1信號通路抑制劑U71322阻斷RBE細胞中PLC-γ1信號通路后，再以CAP處理RBE細胞，MTT方法和流式細胞儀檢測RBE細胞增殖和凋亡能力的變化情況。結果與0 μmol/L CAP處理組相比，50、100、150、200 μmol/L的CAP可顯著抑制RBE細胞的增殖能力(P<0.01)，并增加RBE細胞的凋亡水平(P<0.01)，且這種作用具有劑量依賴性。Western印跡結果顯示，CAP顯著活化RBE細胞中的PLC-γ1信號通路，且隨著CAP處理濃度的升高，PLC-γ1信號通路活化水平逐漸升高。U71322阻斷RBE細胞中的PLC-γ1信號通路后，CAP抑制RBE細胞的增殖能力顯著降低(P<0.01)。結論通過活化PLC-γ1信號通路，CAP可抑制RBE細胞的增殖能力，并促進RBE細胞凋亡。

關鍵詞〔〕辣椒素；磷脂酶C-P1信號通路；膽管癌

中圖分類號〔〕R73〔

第一作者：江愷(1986-)，男，碩士，住院醫師，主要從事肝膽胰外科疾病研究。

膽管癌(CCA)具有惡性程度高、預后差等特點，死亡原因多為腫瘤復發或轉移〔1〕。已知CCA的危險因素包括原發性硬化性膽管炎(PSC)、肝硬化、慢性乙型和丙型肝炎病毒感染、糖尿病、肥胖、吸煙和飲酒等〔2，3〕。CCA通常在發現時已處于癌癥的晚期，僅能采用光動力治療(PDT)、全身化療和(或)放射治療，即便如此患者的治愈率卻未得到明顯提高。辣椒素(CAP)是從紅辣椒的果實中萃取物獲得的紅辣椒活性成分，不僅能減少炎癥及疼痛，還對多種胃腸道腫瘤細胞具有抗增殖的作用〔4〕。然而，CAP在腫瘤形成中的作用目前還存在很大爭議；也有文獻報道，CAP具有促進癌細胞增殖生長的作用〔5〕。本研究通過體外實驗觀察CAP對CCA腫瘤細胞系增殖和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1細胞培養與處理人CCA細胞系RBE用含10%胎牛血清(BSA)的RPMI-1640培養基培養于37℃、5%CO2的培養箱中。細胞長至80%融合進行傳代培養，至細胞進入對數生長期開始功能實驗。活化實驗中采用0、50、100、150、200 μmol/L的CAP及200 μmol/L的CAP處理0、24、48、72 h。

1.2細胞總蛋白提取上述CAP處理細胞以冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，400 r/min離心，5 min；于細胞沉淀中加入蛋白酶磷酸酶抑制劑和適量的CytoBuster 蛋白提取試劑，高速渦旋細胞裂解混合物25 s，室溫放置15 min；4℃，12 000 r/min離心15 min；吸取上清部分即細胞總蛋白，除留部分樣品檢測蛋白濃度外，其余分裝10 μl/管，-80℃凍存。

1.3二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度按試劑盒說明書進行標準品BSA稀釋；按體積比50∶1混合BCA 試劑盒中的試劑A和試劑B，獲取工作液；ELISA板中每孔加入200 μl工作液，隨后加入25 μl倍比稀釋的標準品或待測樣品，每種樣品設置3復孔。37℃孵育30 min；振蕩器短暫混勻后在波長562 nm處測定OD值；根據標準品的光密度值和濃度梯度繪制標準曲線，根據標準曲線及待測樣品的OD值推算各蛋白樣品濃度。

1.4Western印跡等量的提取蛋白經5%濃縮膠和8%的分離膠分離后，半干轉印至硝酸纖維素膜上，以含5% BSA的Tris鹽酸緩沖液(TBST)室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜孵育。第二天用0.1% TBST洗膜3次，每次5 min，加入相應的辣根過氧化物酸(HRP)標記的二抗，室溫孵育1 h。0.1% TBST洗膜3次，硝酸纖維素膜以Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化學發光底物對條帶進行顯色。β-actin作為內參對照。所有實驗至少重復3次。

1.5噻唑藍(MTT)增殖檢測上述CAP處理的細胞接種于96孔培養板中，每孔中加入20 μl的MTT溶液，作用4 h后吸出上清，加入150 μl的DMSO溶液，低速振蕩10 min后，波長490 nm處測定OD值。阻斷磷脂酶C(PLC)-γ1信號通路實驗中，在加入完全培養基及CAP前，先以U73122(5 μmol/L)預處理細胞1 h。細胞增殖率=(實驗孔平均值/對照孔平均值)×100%。

1.6凋亡率檢測收集上述CAP處理的細胞，1 000 r/min離心，5 min，1% BSA PBS洗滌1次。用100 μl Binding緩沖液將細胞重懸，加入2 μl Annexin V染料和0.1 μl碘化丙啶(PI)染料，避光15 min，流式細胞儀檢測。阻斷PLC-γ1信號通路實驗中，在加入完全培養基及CAP前，先以U73122(5 μmol/L)預處理細胞1 h。

1.7統計學分析應用SPSS15.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1CAP對RBE細胞增殖和凋亡能力的影響CAP可顯著抑制RBE細胞的增殖能力，并促進RBE細胞的凋亡；隨著CAP濃度的升高和處理時間的延長，RBE細胞的增殖能力逐漸降低(P<0.01)，而凋亡水平則逐漸升高(P<0.01。見表1。

2.2CAP對RBE細胞中PLC-γ1信號通路活化的影響隨著CAP濃度的升高和處理時間的延長，RBE細胞中PLC-γ1信號通路活化水平逐漸升高。見圖1。

表1　CAP對RBE細胞增殖和凋亡能力的影響

與前一組比較：1)P<0.01

A：不同濃度CAP處理RBE細胞后；B：200 μmol/L CAP處理RBE細胞不同時間 圖1　Western印跡檢測CAP對RBE細胞中 PLC-γ1蛋白磷酸化(P-PLC-γ1)水平的影響

2.3U73122可阻斷RBE細胞中PLC-γ1信號通路活化以U73122(5 μmol/L)預處理細胞1 h，可顯著阻斷RBE細胞中PLC-γ1信號通路的活化。見圖2。

2.4PLC-γ1信號通路在CAP調控RBE細胞增殖和凋亡中的作用與CAP處理組相比，阻斷RBE細胞中PLC-γ1信號通路后，RBE細胞的增殖能力顯著升高(P<0.01)，凋亡水平則顯著降低(P<0.01)。見表2。

圖2　PLC-γ1信號通路阻斷效果檢測

組別增殖率凋亡率對照組93.56±93.564.94±1.99CAP組14.56±14.561)40.45±7.461)CAP+U73122組92.45±18.241)5.34±2.011)

與前一組比較：1)P<0.01

3討論

本研究結果顯示，CAP可顯著抑制人CCA細胞系RBE的增殖能力，并促進RBE細胞凋亡。與文獻〔6，7〕報道的CAP對多種胃腸道腫瘤細胞具有抗增殖的作用，以及CAP可抑制宮頸癌Hela細胞的增殖能力相一致。然而，也有文獻〔8〕報道，CAP具有促進癌細胞增殖生長的作用。這些文獻報道結果的不一致可能是因為體外實驗條件的不同，已知胰島素在低濃度時具有存進腫瘤細胞增殖的作用，而高濃度時可抑制腫瘤細胞增殖。因此，不同實驗中采用的CAP濃度不同可能會導致結果的不同。此外，也可能是不同的腫瘤細胞對CAP的反應性不同所致。已知CAP可通過調控細胞內的Ca2+流動而對細胞的增殖和凋亡發揮調控作用〔9〕。PLC-γ1信號通路在調控細胞內的Ca2+流動中具有重要的作用。激活的PLC-γ1可通過分解磷脂酰肌醇 4，5-二磷酸(PIP2)而產生甘油二酯(DAG)和 1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)，IP3與細胞內鈣庫中的IP3受體結合即可引起細胞內的Ca2+流動〔10〕。本文結果顯示，在阻斷PLC-γ1信號通路后，CAP抑制RBE細胞的增殖能力以及促進RBE細胞的凋亡能力均被顯著阻斷。

綜述所述，本研究結果提示CAP可通過激活RBE細胞中的PLC-γ1信號通路，引起細胞內的Ca2+流動，進而抑制RBE細胞的增殖能力，并促進RBE細胞的凋亡水平，從而在CCA的發生發展中發揮一定的治療作用。已知Ca2+流動在維持細胞的增殖活化中也具有重要作用，CAP通過調控Ca2+流動而抑制RBE細胞的增殖能力，并促進RBE細胞的凋亡水平這一作用可能與破壞了RBE細胞內的Ca2+穩態有關，然而確切的機制還有待進一步的研究。

4參考文獻

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10Huang Y，Wange RL.T cell receptor signaling：beyond complex complexes〔J〕.J Biol Chem，2004;279(28)：28827-30.

〔2015-01-21修回〕

(編輯袁左鳴)