枸櫞酸誘發豚鼠咳嗽模型實驗條件

枸櫞酸誘發豚鼠咳嗽模型實驗條件

盧素紅張超然1吳先林2徐擁建

(暨南大學醫學院，廣東廣州510632)

摘要〔〕目的研究可能影響枸櫞酸誘發豚鼠咳嗽模型的多種因素，減小外界因素對模型制作的影響，復制出穩定的豚鼠咳嗽模型。方法比較不同體重、性別、霧化容積和霧化時間條件對枸櫞酸誘發豚鼠咳嗽的影響。結果在相同實驗條件下，體重180～220 g豚鼠的咳嗽次數明顯多于體重280～320 g；體重180～220 g豚鼠咳嗽潛伏期明顯短于體重280～320 g；5 L霧化容積中豚鼠咳嗽的次數明顯比3 L多；雌性豚鼠的咳嗽潛伏期長于雄性；性別和枸櫞酸霧化時間對豚鼠咳嗽次數的影響不明顯。結論體重和霧化容積對豚鼠咳嗽次數可產生明顯影響，在運用枸櫞酸制作豚鼠咳嗽模型時應嚴格控制實驗條件，有利于復制出穩定的咳嗽模型。

關鍵詞〔〕咳嗽模型；枸櫞酸

中圖分類號〔〕R56〔

1廣東省中醫院2暨南大學第一附屬醫院

第一作者：盧素紅(1982-),男,博士,主要從事心腦血管病研究。

咳嗽主要涉及環節包括：傳入神經、呼吸道神經末梢感受器、延髓咳嗽中樞和傳出神經。人體呼吸道黏膜上神經末梢感受器上分布著許多機械感受器、化學感受器和肺牽張感受器，當黏液、灰塵或異物等機械刺激及煙熏、毒氣等化學刺激呼吸道感受器時，支氣管痙攣引起肌張力增加，神經末梢感受器接受信號，激活“咳嗽受體”，將傳入沖動沿迷走神經傳入纖維，傳至延髓咳嗽中樞孤立束神經核區，在該部位整合各種傳入沖動，興奮位于延髓背側部的咳嗽中樞，引發咳嗽〔1〕。關于咳嗽動物模型的論述均以少數經典、具代表性的動物模型為主，如：多采用機械、化學和電刺激等方法刺激動物的神經和感受器，引發咳嗽。本實驗室比較不同體重、不同性別、不同霧化容積和不同霧化時間條件，對枸櫞酸誘發豚鼠咳嗽的影響，旨在為枸櫞酸致豚鼠咳嗽模型提供最佳的方法學依據。

1材料與方法

1.1實驗動物Hartley豚鼠，SPF級，180～220 g，100只；280～320 g，30只，購自廣東省醫學實驗動物中心。實驗動物合格證號：0106662，使用許可證號：SYXK(粵)2008-0003，廣東省科學技術廳簽發。豚鼠飼養籠材質為不銹鋼，飼養籠尺寸為55 cm×37 cm×40 cm，群養。動物房環境溫度范圍控制在19℃～26℃，日溫差不超過4℃，相對濕度范圍控制在40%～70%，換氣次數為8～10次/h，12 h照明/12 h黑暗明暗交替，工作照度為150-300Lx，動物照度為100-200Lx。

1.2材料枸櫞酸分析純，廣州化學試劑廠，規格：500 g/瓶，批號：20100204-2。電子天平BS224S、BP34，2013年已檢定，均為一年檢定一次，均為北京賽多利斯儀器系統有限公司產品。超聲霧化器為廣東粵華醫療器械廠有限公司產品。

1.3方法試驗前進行動物篩選：將豚鼠分別置于5 L燒杯內，燒杯用保鮮膜密閉，開一小口與超聲霧化器的玻璃管相連，采用噴霧器默認的最大噴霧力度(MAX)，超聲霧化器將17.5%枸櫞酸溶液噴入燒杯，持續霧化0.5 min(30 s)后，立即將超聲霧化器的霧化管與燒杯斷開。在通入枸櫞酸的同時，用秒表計時，記錄自噴霧起5 min內豚鼠咳嗽次數(豚鼠引嘴并聽到響亮咳聲，為一次咳嗽)，低于10次者，不予選取〔2〕。將篩選合格的Hartley豚鼠100只，平均分成5組，見表1。在篩選結束后第三天同上法引咳，在噴霧枸櫞酸溶液的同時，用秒表計時，記錄豚鼠5 min內咳嗽次數(次)和咳嗽潛伏期(s)。咳嗽潛伏期〔3〕指噴霧枸櫞酸開始時間至發生咳嗽所需的秒數，咳嗽的表現為：豚鼠咳嗽聲響亮，應以聽到計算。

1.4統計學方法采用SPSS13.0軟件進行方差分析，當組間方差齊時，組間比較采用Student-T檢驗(非配對T檢驗)；組間方差不齊時，采用校正的Student-T檢驗。

2結果

2.1性別對豚鼠咳嗽次數的影響B組咳嗽潛伏期明顯長于A組(P<0.05)，B組咳嗽次數略少于A組，差異不顯著(P>0.05)。見表1。

2.2體重對豚鼠咳嗽次數的影響C組比A組咳嗽潛伏期明顯延長，咳嗽次數明顯減少(P<0.01)。見表1。

2.3霧化時間對豚鼠咳嗽次數的影響D組與A組咳嗽次數和咳嗽潛伏期差異不顯著(P>0.05)。見表1。

2.4霧化容積對豚鼠咳嗽次數的影響E組咳嗽次數明顯低于A組(P<0.05)，但咳嗽潛伏期差異不顯著(P>0.05)。見表1。

表1　各種實驗條件對枸櫞酸致豚鼠咳嗽的影響( n=20)

與A組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3討論

化學刺激法致豚鼠霧化吸入枸櫞酸，引發咳嗽，具有霧化時間和濃度可控，操作簡單、豚鼠咳嗽聲大、易于辨別等優點。枸櫞酸致豚鼠咳嗽模型是常用的動物咳嗽模型，但目前各文獻對枸櫞酸誘發咳豚鼠咳嗽模型的各種試驗條件記載不一致，霧化時間為10、30、60 s等、霧化容積有3、5 L燒杯等。

年齡階段的不同導致了體重差異，而不同階段的年齡對化學刺激的敏感性是不一致的，如兒童支氣管黏膜血管豐富，黏液分泌量少，纖毛運動差而清掃能力弱，故對化學刺激更加敏感。一般來說，年齡越小，對化學刺激越敏感，所以體重輕的豚鼠對枸櫞酸更敏感，咳嗽次數多、咳嗽潛伏期短。

在實驗過程中發現，雌性動物的咳嗽潛伏期長于雄性，與劉軍等〔4〕的研究一致，考慮原因是雌激素對機體的保護作用，導致雌性豚鼠更耐受，這點提示在實驗過程中，不同受試物組的雌雄動物數應一致，盡量避免因性別而導致的模型差異。

在相同條件下，霧化時間30 s與60 s雖未見顯著性差異，但霧化結束后，霧化時間60 s的豚鼠精神狀態較差，所以在實驗中應選擇引咳效果佳且對動物造成損傷小的最佳霧化時間。

本文5 L霧化容積對模型的影響與王靜波〔5〕的研究一致，考慮與通氧情況有關。在實驗過程中，應注意超聲霧化器藥杯內枸櫞酸的體積量會影響霧化濃度，所以實驗過程中要統一藥杯內枸櫞酸的容積。本研究中，藥杯內每次添加枸櫞酸溶液的體積為20 ml，做完3只豚鼠后更換枸櫞酸溶液，可以防止揮發。不同的霧化器即使霧化濃度相同，也可能會存在一定的差異。因此，霧化過程中要將各組動物均勻分到各個霧化器。總之，影響動物實驗結果的因素有很多，包括動物自身因素、飼養環境因素、營養因素、實驗技術因素等，因此必須嚴格控制實驗條件才能獲得準確、可重復性的動物模型。

4參考文獻

1鄧偉吾.咳嗽的發生機制與臨床〔J〕.內科理論與實踐，2006；1(1)：50-3.

2徐叔云.藥理實驗方法學〔M〕.北京：人民衛生出版社，2002：1363-4.

3羅霄山，許家騮，張誠光，等.咳喘樂顆粒鎮咳、祛痰、平喘作用的實驗研究〔J〕.中藥材，2004；27(7)：520-1.

4劉軍，石璐，黃雷雷，等.枸櫞酸引咳豚鼠動物模型的方法學研究〔J〕.四川醫學，2009；30(4)：463-4.

5王靜波.枇杷花止咳抗炎藥效學研究〔D〕.成都：四川師范大學，2009：20-1.

〔2014-10-26修回〕

(編輯安冉冉/張慧)

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