Clostridium saccharobutylicum DSM 13864細胞表面理化特性及固定化細胞產丁醇的性能

陳強，董晉軍，許國超，韓瑞枝，倪曄

（江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

Clostridium saccharobutylicum DSM 13864細胞表面理化特性及固定化細胞產丁醇的性能

陳強，董晉軍，許國超，韓瑞枝，倪曄

（江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

糖丁基梭菌Clostridium saccharobutylicum DSM 13864能利用多種糖類為底物發酵產丁醇。本文研究了該菌體細胞表面的理化特性，并以磚塊作為細胞固定化材料進行丁醇發酵。采用細菌吸附有機溶劑（MATS）法證明糖丁基梭菌細胞表面有強烈的親水性，并且等電點在pH值為3左右，這些特性有利于菌體與表面親水多孔的磚塊吸附。在60g/L葡萄糖發酵培養基中，以5～8目磚塊作為固定化材料，流速為1.1L/min，發酵48h后，丁醇的濃度、得率和生產率分別達到11.02g/L、0.18g/g和0.23g/(L?h)，相比懸浮細胞發酵分別提高了10.53%、5.88%和9.52%。結果表明：磚塊作為一種固定化材料可有效提高糖丁基梭菌的發酵產丁醇水平。

糖丁基梭菌；丁醇；固定化；細菌吸附有機溶劑；磚塊

丙酮丁醇發酵工業曾經是僅次于乙醇發酵工業的第二大發酵產業。由于石油工業的發展，發酵法生產丙酮丁醇逐漸被淘汰。但隨著人類對石油資源逐年增長的消費需求，發酵法產丁醇又重新引起人們的重視[1]。丁醇作為一種新型的能源，和乙醇相比，具有以下優點：與汽油調和的配伍性更好，能量密度和燃燒值更高，蒸汽壓較低，可經石油管道運輸，腐蝕性小，水溶性低等[2]。由于高濃度的丁醇對細胞膜的磷脂結構有破壞作用，從而影響細胞代謝，抑制菌體生長[3]。因此，近年來許多研究集中于降低發酵液中丁醇濃度和提高菌種的丁醇耐受性[4]。

在過去的幾十年中，已報道的用于降低發酵液中丁醇濃度、降低生長抑制、提高溶劑生產率的主要方法包括：吸附[5]、液-液萃取[6]、滲透蒸發[7]和汽提[8]。另外，研究證明細胞固定化在丁醇生產中能夠提高細胞密度，增強發酵穩定性和提高溶劑耐受性等[9]。用于固定化細胞研究的載體包括：角叉菜膠-殼聚糖[10]、藻酸鈣[11]、纖維素材料[12]（如甘蔗渣、纖維固定床）等。Yen等[13]在ABE分批發酵中使用磚塊作為固定化材料，丁醇終濃度增加了3.60%，Chen等[9]使用毛巾作為固定化材料，實現分批發酵中丁醇濃度提高了 26.19%，丁醇得率達0.20g/g。Vichuviwat等[14]使用沸石-13X，丁醇濃度達到8.58g/L，較對照提高了62.19%。

在本文作者研究室的前期研究中，建立了 C. saccharobutylicum的兩級半發酵體系，成功運行 8天，平均生產率（第二級）達 1.05g/(L?h)[15-16]；以玉米桔桿水解液為底物進行了四級連續發酵，連續運行 220h，溶劑生產率和溶劑得率分別達到0.43g/(L?h)和 11.43g/L[17]。然而，以上研究皆基于懸浮細胞發酵，為進一步提高C. saccharobutylicum發酵產丁醇的濃度、得率和生產率，有必要選擇一種合適的固定化材料。本文首先研究了 C. saccharobutylicum細胞表面的理化特性，然后選擇磚塊作為固定化材料進行了該菌株固定化細胞的發酵產丁醇研究。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗菌種

Clostridium saccharobutylicum DSM 13864，購自德國微生物和細胞保藏中心（DSMZ）。

1.2 培養基

種子培養基（RCM 培養基）：酵母膏3g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，可溶性淀粉1g/L，葡萄糖5g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/L，NaCl 3g/L，NaAc 3g/L，pH值6.5，115℃滅菌20min。

TYA培養基：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨10g/L， K2HPO42g/L，pH值 6.5，115℃滅菌20min。

葡萄糖發酵培養基：葡萄糖 60g/L，玉米漿干粉10g/L，CaCO34.0g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO40.5g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，pH值 6.0，115℃滅菌20min。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子培養

室溫保藏的菌種孢子懸液以10%的接種量轉接于RCM培養基中，37℃厭氧培養 12～18h。

1.3.2 細胞親疏水性

活化后的種子液以8%的接種量接種到TYA培養基中，37℃靜止培養，分別收集處于對數期和穩定期的菌體，離心后懸浮于磷酸鉀緩沖液（0.1mol/L，pH值 6.0）中，維持初始OD400（A0）在0.8～1.0之間。將4.8mL菌懸液分別與0.8mL溶劑（氯仿、正十六烷、乙酸乙酯和癸烷）在旋渦振蕩儀上充分混合90s，靜止15min后分層，取水相樣品，在400nm下測定吸光值A。吸附率計算公式為式（1）。

1.3.3 電泳遷移率測量

在對數中后期（OD600～3.0）收集細胞，離心后懸浮于磷酸鉀緩沖液（0.1mol/L，pH值 6.0）中，維持初始吸光值OD400（A0）在0.8～1.0之間，用0.1mol/L HCl或者 NaOH調節上述菌懸液 pH值2～8，采用納米粒度電位儀Zetasizer Nano-ZS（伍斯特，英國）檢測電泳遷移率。

1.3.4 固液比優化

把來自于本地建筑工地的磚塊碾碎后篩選 5～8目大小的顆粒，用去離子水清洗數次，121℃滅菌1h，烘干待用。在裝有 150mL葡萄糖培養基的250mL搖瓶中分別加入40g、60g、80g和100g處理后的磚塊，接種后靜置培養于37℃培養箱，以不加磚塊培養基作為對照。48h后檢測發酵結果。

1.3.5 吸附實驗

在穩定期收集細胞，將離心獲得的菌體用磷酸鉀緩沖液洗滌兩次，然后重新懸浮于相同的磷酸鉀緩沖液中，維持初始OD600在0.8～1.0之間，將盛有 110g磚塊的 250mL血清瓶通過兩條硅膠管與150mL血清瓶連接，形成循環流通體系，將275mL菌懸液緩慢加入到150mL血清瓶，通過蠕動泵使菌懸液流入整個體系，并保持菌液循環流速為1.1L/h，每0.5h從體系中取出2mL菌液檢測OD600。實驗結束后的磚塊樣品用于電鏡掃描。

1.3.6 固定化細胞發酵穩定性實驗

磚塊60g加入裝有150mL葡萄糖發酵培養基的250mL帶硅膠管血清瓶中，接種48h后，使用蠕動泵抽干發酵液，再泵入新鮮培養基，然后靜置培養，每48h重復一次，一共進行10個循環。每次取樣5mL用于檢測。

1.3.7 細胞固定化發酵

在裝有1.5L葡萄糖培養基的3L發酵罐中接種150mL種子培養液，恒溫37℃培養。當細胞生長達到對數中期（OD600約2.0）時，將固定化裝置通過滅菌的硅膠管連接到發酵罐上，并用蠕動泵保持循環流速為1.1L/h。固定化裝置為盛有600g無菌磚塊的玻璃容器（i. d. 70mm×250mm，250mL工作體積），整套裝置連接如圖1所示。

圖1 細胞固定化發酵裝置示意圖

1.3.8 分析方法

吸光度測定：OD400和 OD600使用分光光度計（上海菁華）測定。

糖含量：葡萄糖濃度采用SBA-40C生物傳感分析儀（山東省科學院生物研究所）測定。

溶劑和有機酸：溶劑（丙酮、乙醇、丁醇）和有機酸（乙酸、丁酸）的測定采用氣相色譜法（GC）。毛細管色譜柱：PEG-20M（30m× 0.32mm×0.5μm）。柱溫條件：初始60℃，保持0.5min 后，以10℃/min的速度升至 120℃，保持 0.5min后，以 15℃/min的速度升至 150℃，保持 0.5min后，以 20℃/min的速度升至190℃，保持1min。進樣口溫度180℃，FID檢測器溫度210℃，進樣量1.0μL，分流比90∶1。尾吹流速29mL/min，H2流速30mL/min，空氣流速300mL/min。

2 結果與分析

2.1 C. saccharobutylicum細胞表面理化特性

細菌吸附有機溶劑（MATS）法由 Bellon-Fontaine等[18]首先應用，是基于微生物碳氫吸附能力法改進而來的用于檢測細胞親疏水性的方 法。MATS法可以測定微生物對不同極性溶劑附著力中路易斯酸堿（i. e.電子供體和電子受體）的相互作用。因此，MATS法是基于比較微生物對具有相同范德華力的單極溶劑（電子供體或者電子受體）和非極性溶劑的親和力差異。本工作選擇了 Bellon-Fontaine等所使用的溶劑：氯仿（電子受體溶劑）和正十六烷（非極性溶劑），乙酸乙酯（電子供體溶劑）和癸烷（非極性溶劑）。圖2顯示兩個生長階段的C. saccharobutylicum細胞對不同溶劑的附著力，包括：氯仿、正十六烷、乙酸乙酯和癸烷。由圖 2可見，C. saccharobutylicum細胞對氯仿表現出最高的附著力，對乙酸乙酯的附著力最低。說明菌體具有較強烈的電子供體特征（路易斯堿），微弱的電子受體特征（路易斯酸），即C. saccharobutylicum細胞的強堿弱酸特征較為顯著。另外，細胞對兩種非極性溶劑的親和力較低，說明菌體具有強烈的親水性，而且對數期細胞的親水性要強于穩定期。當水或者親水性液體（如甘油、PEG 200等）滴到磚塊表面后，液滴能在磚塊表面迅速地鋪展開，說明磚塊表面浸潤性良好，有較好的親水性，有利于親水性菌體的吸附。

圖2 不同生長階段的C. saccharobutylicum細胞的有機溶劑附著力分析

電泳遷移率通常反映細胞表面的帶電荷情況。本文測定C. saccharobutylicum細胞在不同pH值環境下的電泳遷移率。圖3反映了穩定期細胞在不同pH值的0.1mol/L磷酸鉀緩沖液中的電泳遷移率。菌體的等電點在pH值為3左右，且當pH值大于3時菌體帶負電。這種現象和其他革蘭氏陽性菌等電點類似[19]，主要是由于細胞壁中磷壁酸的磷酸二酯鍵基團或者磷脂中的磷酸聚合基團（R—H2PO4/R—HPO42?）（pKa約等于 2.1）和肽聚糖 COOH/COO?（4

圖3 C. saccharobutylicum細胞的電泳遷移率測定

2.2 磚塊固定化C. saccharobutylicum細胞的穩定性

如圖4結果所示，每150mL發酵培養基加入60g磚塊時，丁醇和總溶劑濃度均達到最高，分別為11.1g/L和 16.0g/L，相比懸浮細胞發酵分別提高了15.6%和17.6%。因此，在隨后的實驗也采用相同的固液比例。根據磚塊吸附率計算，約65%的細胞在循環4.5h之后被吸附到磚塊顆粒上（如圖5）。如電鏡照片圖6(a)顯示，未固定化磚塊表面粗糙，有眾多的褶皺，因此具有較大的菌體有效接觸面積。而固定化后[圖6(b)]，載體褶皺表面已被菌體覆蓋，菌體在載體表面能生長和分裂，并保持活力。穩定性實驗結果顯示（圖7），丁醇濃度保持在10g/L以上，總溶劑穩定在15g/L以上，表明吸附于磚塊表面的菌體在發酵液的更換過程中一直保持活性。在以后的分批發酵應用中，可以省去種子培養的過程，可降低發酵成本，提高生產效率。

圖4 150mL溶液中磚塊添加量對C. saccharobutylicum發酵產丁醇的影響

圖5 C. saccharobutylicum細胞的磚塊吸附時間進程曲線

圖6 C. saccharobutylicum細胞吸附到前后的磚塊表面電鏡照片

圖7 磚塊固定化C. saccharobutylicum 細胞的10個循環重復分批發酵

2.3 磚塊固定化C. saccharobutylicum細胞發酵產丁醇

在3L發酵罐中研究固定化細胞對ABE發酵的影響。如圖8所示，在固定化發酵40h后，丁醇和總溶劑終濃度為11.02g/L和16.55g/L，丁醇生產率和得率分別為0.23g/(L?h)和0.18g/g。而對照組（懸浮細胞發酵）中，丁醇和總溶劑濃度分別為9.97g/L和15.54g/L，丁醇生產率和得率分別為0.21g/(L?h)和 0.17g/g。固定化發酵丁醇和總溶劑終濃度較對照組分別提高了10.53%和6.80%；丁醇的生產率和得率較對照組分別提高了9.52%和5.88%。與其他報道相似，與懸浮細胞相比，固定化細胞通常能提高丁醇生產率[21]。本工作首次采用磚塊作為載體固定化C. saccharobutylicum細胞。表1匯總了近年來固定化梭菌發酵產丁醇的研究，磚塊、離子交換樹脂amberlite[22]和毛巾[23]都是表面親水的載體，能吸附表面親水的梭菌，而沸石13X在發酵液pH值環境下表面帶正電[24]，能與同樣環境下帶負電的菌體在靜電力作用下相結合，因此都是良好的固定化材料。但是和磚塊固定化 C. acetobutylicum BCRC 10639 和C. beijerinckii TISTR 1461相比，本工作中丁醇生產率更高，約為C. beijerinckii TISTR 1461的2倍。和離子交換樹脂amberlite及沸石相比，磚塊是一種更加易得和便宜的材料。另外，磚塊的預處理很簡單，不需要化學處理。雖然采用毛巾作為固定化材料能得到相對較高的生產率和得率[9，25]，但是毛巾在長期的操作中容易染菌，并且回收過程繁瑣。而磚塊只需要清洗數次，烘干后便能再次使用。值得注意的是，固定化細胞發酵殘糖濃度低于對照組。固定化細胞發酵結束時，殘糖濃度為1.9g/L，而對照組中殘糖濃度為 5.3g/L，這可能是因為在帶有固定化循環裝置的體系中培養基的利用更為充分。

圖8 磚塊固定化C. saccharobutylicum的發酵時間進程曲線

表1 固定化梭菌細胞分批發酵產丁醇研究的比較

3 結 論

通過研究 C. saccharobutylicum細胞的表面特性，以磚塊為固定化材料初步探索了固定化對丁醇發酵的影響，得出以下主要結論。

（1）通過 MATS檢測法證明了 C. saccharobutylicum細胞表面具有強堿弱酸的特性，有強烈的親水性，并且等電點在pH值為3左右，這些特征有利于與親水表面的磚塊相結合。

（2）搖瓶發酵實驗中，當150mL葡萄糖培養基加入60g磚塊時，丁醇和總溶劑達到最高，相比懸浮細胞發酵分別提高了15.6%和17.6 %，電鏡圖片證明磚塊表明細胞吸附效果明顯，穩定性實驗表明固定化后的菌體能保持細胞活性。

（3）3L發酵罐發酵實驗中，丁醇的終濃度為11.02g/L，較對照組提高了10.53%；丁醇生產率和得率分別為0.23g/(L?h)和0.18g/g，較對照組分別提高了9.52%和 5.88%。表明磚塊作為固定化材料可進一步應用于連續發酵實驗中。

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Enhanced butanol production by Clostridium saccharobutylicum DSM 13864: Physicochemical property and immobilization

CHEN Qiang，DONG Jinjun，XU Guochao，HAN Ruizhi，NI Ye
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

Clostridium saccharobutylicum DSM 13864 is a solventogenic strain capable of producing ABE solvents (acetone，butanol and ethanol) from various saccharides. To validate its potential in ABE fermentation with cell immobilization，the physicochemical properties of C. saccharobutylicum DSM 13864 cells were investigated. The microbial adhesion to solvents (MATS) analysis shows that the cell surface is hydrophilic due to its strong electron-donating property，and negatively charged at pH above 3. Brick was used as an immobilization material in ABE fermentation with C. saccharobutylicum. At a flow rate of 1.1L/min through the immobilized C. saccharobutylicum，the titer and yield of butanol reached 11.02g/L and 0.18g/g respectively，and butanol productivity was 0.23g/(L?h) in batch fermentation，representing improvements of 10.53%，5.88% and 9.52% compared with free cell fermentation，respectively. The results suggest that cell immobilization with brick is efficacious in enhancing butanol production by C. saccharobutylicum.

Clostridium saccharobutylicum; butanol；immobilization; microbial adhesion to solvents (MATS); brick

Q 815

A

1000-6613（2015）12-4214-06

10.16085/j.issn.1000-6613.2015.12.014

2015-03-18；修改稿日期：2015-04-16。

國家 973計劃（2011CB710800）及國家自然科學基金（21276112，31401634）項目。

陳強（1989—），男，碩士研究生。聯系人：倪曄，教授，主要研究方向為生物催化和酶工程。E-mail yni@jiangnan.edu.cn。