結核分枝桿菌利福平耐藥與rpoB基因突變特征的關系探討

鄒 悅肖 謙蘇海濤

結核分枝桿菌利福平耐藥與rpoB基因突變特征的關系探討

鄒 悅1肖 謙2蘇海濤3

目的分析青島地區結核分枝桿菌利福平耐藥與rpoB基因突變特征的關系。方法青島地區14株利福平敏感的結核分枝桿菌以及54株利福平耐藥的結核分枝桿菌的rpoB基因段應用PCR-DNA測序法給予分析。結果54株利福平耐藥菌株中，其中44株出現了rpoB基因81bp核心區突變，而其中14株利福平敏感菌株中未出現rpoB基因81bp核心區突變，比較差異具有統計學意義（P＜0．05）；其中38株利福平低濃度耐藥菌株中出現了30株rpoB基因81bp核心區突變，其中16株利福平高濃度耐藥菌株中出現了14株rpoB基因81bp核心區突變，比較差異具有統計學意義（P＜0．05）；其中18株非耐多藥菌株中出現了14株rpoB基因81bp核心區突變，其中36耐多藥菌株中出現了30株rpoB基因81bp核心區突變，比較差異具有統計學意義（P＜0．05）。結論rpoB基因81bp核心區突變是青島地區結核分枝桿菌對利福平耐藥的主要機制。

分枝桿菌；結核；利福平；突變；青島

結核病是全球以及目前我國嚴重的一種公共衛生問題［1］。我國是被WHO列為“耐藥結核病需引起警示”的國家之一，研究報道發現我國利福平（RFP）耐藥率為7.5%，并且耐多藥率（MDB-TB）為6.8%［2］。本研究旨在分析青島地區利福平耐藥結核分枝桿菌的rpoB基因突變特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 來源于2009年1月～2012年12月青島市胸科醫院確診68株結核分枝桿菌臨床分離株的肺結核患者痰標本，其中包括54株耐藥菌株，14株利福平敏感菌株。利福平耐藥菌株中包括16株高濃度耐藥菌株，38株低濃度耐藥菌株；36株耐多藥菌株，18株非耐多藥菌株。

1.1.2 主要儀器設備 采用加拿大BBI公司生產的PCR反應擴增儀，采用美國ABI公司生產的370測序列分析儀，采用湘儀離心機儀器有限公司生產的YXJ-2離心機，采用上海精益有機玻璃制品儀器廠生產的H6-1微型電泳槽，采用Gene Genius公司生產的凝膠成像系統。

1.1.3 主要試劑 6×DNA Loading Dye、dNTP、TaqDNA聚合酶、MgCl2、10×PCR Buffer（生工）；10×TAE；生工SK1141PCR產物純化回收試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 細菌DNA的抽提 取100 μL菌懸液加自制的裂解液[（50 mmol/L NaOH、10 mmol/L Tris.HCl（pH 8.0）、1% Triton X-100、1% NP-40、0.5 mmol/L EDTA（pH8.0））200 μL，混勻，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液作模板。置-20℃保存備用。

1.2.2 PCR擴增 根據結核分枝桿菌標準菌株H37Rv的 rpoB基 因（Gene ID： 888164） 序 列 設 計 引物：上 游5′- AGGACGTGGAGGCGATCA-3′， 下 游5′-AACGGGTTGACCCGCGCGTA -3′，擴增rpoB基因基因片段長度為307 bp片段， 該片段包括了易發生突變的81bp核心區。

1.2.3 PCR反應體系及反應條件 采用50 μL體系，包括模板1 μL、上下游引物各1μL、dNTP 10 mmol/L 1 μL、Taq Buffer 5 μL、25 mmol/L MgCl25 μL、5 U/μL Taq酶0.5 μL、水36.3 μL；反應條件：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火35 s，72 ℃延伸40～50 s，72 ℃修復延伸5～8 min，35個循環。

1.2.4 測序 用PCR產物純化回收試劑盒（生工SK1141）回收DNA擴增片段，送上海生工生物工程股份有限公司測序，在GeneBank中查到rpoB基因（Gene ID：888164）的序列進行比對。

1.3 統計學分析

采用PEMS 3.1軟件分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

見圖1。本研究所有結核分枝桿菌臨床分離株基因擴增后長度為307bp的片段，并且顯示擴增陽性率為100%。

圖1 1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 20 min電泳觀察

2.1 DNA測序結果

14株利福平敏感菌株中均未發生rpoB基因81bp核心區突變，而54株利福平耐藥菌株中有44株發生了rpoB基因81bp核心區突變，基因突變率為81.48%（44/54）；44株中30株（占68.18%）為531位點TCG→TTG突變，10株（占22.72%）為526位點CAC→TAC突變，2株（占4.55%）為81bp核心區511位CTG→CCG突變，2株（占4.55%）為511位點CTG→CCG和526位點CAC→AAC雙位點突變。38株利福平低濃度耐藥菌株中有30株發生了rpoB基因81bp核心區突變，突變率為78.95%（30/38），其中22株為81bp核心區531位點TCG→TTG變異，4株為526位點CAC→TAC突變，2株（占4.55%）為511位點CTG→CCG突變，2株（占4.55%）為511位點CTG→CCG和526位點CAC→AAC雙點突變；16株利福平高濃度耐藥菌株中有14株發生了rpoB基因81bp核心區突變，突變率為87.50%（14/16），其中8株為531位點TCG→TTG突變，6株為526位點CAC→TAC突變。18株非耐多藥菌株中有14株發生了rpoB基因81bp核心區突變，突變率為77.78%（14/18），其中10株（占68.18%）為531位TCG→TTG突變，2株（占22.72%）為526位點CAC→TAC突變，2株（占4.55%）為511位點CTG→CCG突變；而36株耐多藥菌株中有30株發生了rpoB基因81bp核心區突變，突變率為83.33%（22/24），其中20株（占68.18%）為531位點TCG→TTG突變，8株（占22.72%）為526位點CAC→TAC突變，2株（占4.55%）為511位點CTG→CCG和526位點CAC→AAC雙點突變。見圖2～圖5。

圖2 511位點CTG→CCG突變（對側鏈）

圖3 526位點CAC→TAC突變（對側鏈）

圖4 531位點TCG→TTG突變（對側鏈）

2.2 rpoB基因81bp核心區突變特征與利福平耐藥表型的關系

見表1。54株利福平耐藥菌株中，其中44株出現了rpoB基因81bp核心區突變，而其中14株利福平敏感菌株中未出現rpoB基因81bp核心區突變，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 利福平耐藥表型與rpoB變異關系

2.3 利福平耐藥濃度與rpoB基因81bp核心區突變的關系

見表2。其中38株利福平低濃度耐藥菌株中出現了30株rpoB基因81bp核心區突變，其中16株利福平高濃度耐藥菌株中出現了14株rpoB基因81bp核心區突變，比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 利福平耐藥濃度與rpoB81bp核心區突變關系

2.4 利福平耐藥菌株是否耐多藥與rpoB基因81bp核心區突變關系

見表3。其中18株非耐多藥菌株中出現了14株rpoB基因81bp核心區突變，其中36耐多藥菌株中出現了30株rpoB基因81bp核心區突變，比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表3 利福平耐藥菌株是否耐多藥與rpoB基因81bp核心區突變關系

3 討論

利福平是一種快速殺菌劑，該藥物作用機制主要是經與結核分枝桿菌RNA聚合酶的β亞單位結合，其中編碼β亞單位的基因被命名為rpoB基因［3］。本研究表明，81.48%（44/54）的利福平耐藥菌株存在rpoB基因81bp核心區突變，而14株對利福平敏感的結核分枝桿菌臨床分離菌株中未發現rpoB基因81bp核心區突變，這說明rpoB基因81bp核心區突變是青島地區結核分枝桿菌對利福平耐藥的主要機制，提示該突變作為青島地區利福平耐藥結核分枝桿菌診斷的分子標記靶點具有較好的臨床應用價值，這將在早期診斷、早期選擇敏感藥物治療耐藥結核病提供較大幫助。

rpoB基因81bp核心區突變率對利福平高濃度耐藥菌株與利福平低濃度耐藥菌株以及是否耐多藥，差異無統計學意義，一定程度上表明rpoB基因81bp核心區突變與耐藥濃度及耐藥程度不相關。還有18.52%利福平耐藥結核分枝桿菌未發現rpoB的變異，說明青島地區還存在利福平耐藥的其他機制，有待進一步研究。此次研究樣本量較小，難以全面反映整個青島地區的利福平耐藥結核分枝桿菌rpoB的變異特征，這些需要以后加大樣本量，進行深入的研究，以期獲得更加全面的科學依據。

［1］肖東樓，趙明剛，王宇等．中國結核病防治規劃實施工作指南［M］．北京：中國協和醫科大學出版社，2009：1．

［2］全國第五次結核病流行病學抽樣調查技術指導組，全國第五次結核病流行病學抽樣調查辦公室．2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告［J］．中國防癆雜志，2012，34（8）：485-508．

［3］朱敏，范玉美，盛國平，等．浙江省耐藥結核分枝桿菌katG、rpoB、embB基因突變特點［J］．研究醫學研究雜志，2008，37（3）：26-29．

The Relationship between the Mycobacterium Tuberculosis Rod Rifampicin Resistant and the Characteristics of the RpoB Gene Mutation

ZOU Yue1XIAO Qian2SU Haitao31 Thoracic 2，Chest Hospital in Qingdao City，Qingdao 266043，China，Medical insurance department of Qingdao Ninth People's Hospital，Qingdao 266000，China，3 Thoracic and three branch，Chest Hospital in Qingdao City，Qingdao 266043，China

ObjectiveTo investigate the relationship between mycobacterium tuberculosis rod rifampicin resistant and the characteristics of the rpoB gene mutation．Methods14 cases of the mycobacterium tuberculosis which sensitive to the rifampicin and 54 cases of rpoB gene of mycobacterium tuberculosis with rod rifampicin resistant， which were analysed with PCR-DNA sequencing．ResultsIn 54 strains of rifampicin ， 44 strains of them have rpoB 81bp core mutations， while 14 strains which sensitive to the rifampicin have no rpoB 81 bp core mutations， with significant difference（P＜0．05）; 30 strains have rpoB 81bp core mutations in all 38 strains with rifampicin low concentration drug resistance; 14 strains have rpoB 81bp core mutations in all 16 strains of rifampicin high concentration drug resistance， with statistical difference（P＜ 0．05）; 14 strains have rpoB 81bp core mutations in all 18 strains of non-resistant; 30 strains have rpoB 81bp core mutations in all 36 strains of multidrug resistance， with statistical difference（P＜0．05）．ConclusionRpoB 81bp core mutation is the primary mechanisms of mycobacterium tuberculosis in Qingdao to the rifampin-resistance．

Mycobacterium，Tuberculosis，Rifampicin，Mutation，Qingdao

R3

B

1674-9316（2015）29-0199-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2015．29．146

1 266043青島市胸科醫院胸二科

2 266000青島市第九人民醫院醫保科

3 266043青島市胸科醫院胸三科