溫度對考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度的影響

趙卓，嵇雅茹，籍浩天，趙海榮，郝錫聯(吉林師范大學生命科學學院，吉林四平136000)

蛋白質是構成生物體細胞組織的重要成分，在生命體內參與細胞構建、物質運轉、營養代謝、激素調控和酶促反應等多種生命活動，在生物體發育過程中幾乎參與所有重大生命事件［1－2］。因此，對蛋白質含量的測定，是生命科學研究領域中最常用檢測手段，對其定性、定量分析是功能分析、食品檢驗、疾病診斷、臨床檢驗中最基礎的分析方法之一。目前，常用的蛋白質測定方法有凱氏定氮法、Folin-酚試劑法、紫外吸收法、雙縮脲法、考馬斯亮藍染色法等［3－6］。鑒于每種蛋白質測定方法都有各自的局限性和優缺點，不能在任何條件下適用于各種蛋白質類型檢測，需考慮到測定過程中的干擾物質、蛋白質性質、外界環境理化因子影響等多種因素，為提升蛋白質測定結果的精準性，需要對蛋白質不同的測定方法進行條件優化與篩選［7－8］。

自1976年Bradford發明快速測定微克量蛋白質的考馬斯亮藍法(G250)以來，考馬斯亮藍法便以靈敏、精準、便捷等測定優勢得到迅速的推廣和廣泛的應用［9－11］?？捡R斯亮藍染料在游離狀態下呈棕紅色，當與蛋白質結合后呈藍青色，蛋白質含量為0～1 000 μg范圍內時，蛋白質與色素結合物在595 nm下的吸光度與蛋白質含量成正比?？捡R斯亮藍法測定蛋白質的優點在于:其一靈敏度高，據估計，考馬斯亮藍法比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍，比Lowry法約高4倍［10］;其二，測定快速、簡便，只需加一種染液，由于染料與蛋白質結合過程只需2 min即可完成蛋白質含量測定［11－12］;其三，干擾物少提升了測定結果的精準性。所以，考馬斯亮藍法自問世以來對蛋白質含量測定得到學術界廣泛接受和認同［12］。

蛋白質定量測定是科研、臨床檢驗中的常見實驗環節，測定精確與否對后續實驗結果的影響至關重要。盡管考馬斯亮藍法測定蛋白質具有快速、靈敏度高、穩定以及測量結果準確等諸多優點，但在蛋白質的測定過程中仍存在很多因素影響蛋白質測定的準確性，諸如溫度、光照等環境因子會對蛋白質測定產生不同程度的影響，研究顯示，溫度對蛋白質結晶具有重要影響［13］。目前未見有關溫度與考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度精準關系方面的研究報道。該研究以已知蛋白濃度為測試樣品，研究溫度在考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度過程中的影響因子和作用程度，為今后科研工作中測定蛋白質濃度準確性提供建議和指導。

1 材料與方法

1.1 標準蛋白質的配制 稱取牛血清白蛋白10 mg，溶于蒸餾水并定容至100 ml，制成100 μg/ml的蛋白質標準液，存放于棕色瓶中，4℃保存備用。

1.2 考馬斯亮藍的制備 稱取G250染料100 mg，溶于50 ml 95%乙醇中，加入85%的磷酸100 ml，磁力攪拌至全部溶解后，蒸餾水定容至1 000 ml，過濾后置于棕色試劑瓶中，4℃保存備用。

1.3 標準曲線方程的建立 取6支試管，分別加入0.2～1.0 ml標準蛋白質溶液和蒸餾水混勻后，向各管中加入5 ml G250溶液。充分搖勻，混合后靜置2 min左右，在595 nm波長處測定OD值。以蛋白質含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線，求得線性回歸方程。

1.4 配置不同濃度的牛血清蛋白 準確配置濃度為100、75、50、25、5 μg/ml的牛血清蛋白，置于棕色瓶中，于 4 ℃冰箱中保存。

1.5 不同溫度處理蛋白質濃度測定 取各濃度蛋白質溶液1 ml，加入5 ml G250 溶液混合后在 0、10、20、30、40、50 ℃條件下孵育，以蒸餾水為空白對照，分光光度計測定OD595值，每隔10 min測得數據。5次重復。

1.6 數據分析與繪圖 根據標準曲線計算待測樣品溶液中的蛋白質含量，試驗所得數據用SPSS軟件進行ANOVA分析，圖中數據采用Mean表示，顯著水平P≤0.05。

2 結果分析

2.1 不同溫度處理下5 mg/ml蛋白質濃度動態變化 表1表明，當蛋白質濃度為5 mg/ml時，在溫度為0℃時，蛋白質濃度測定值為10.95 μg/ml，與標準蛋白濃度比誤差百分比達到118.93%;當溫度為10～30℃時，蛋白質濃度測定值顯著升高，與標準蛋白濃度比誤差百分比達到156.8%以上;當溫度為40～50℃時，蛋白質濃度測定值升高極顯著，與標準蛋白濃度比誤差百分比高達215%以上。此外，各溫度條件下，蛋白質濃度測定值都會隨孵育時間的延長顯著增加，其中40℃孵育30 min和50℃孵育20 min后蛋白質濃度超出分光光度計測定范圍。

表1 不同溫度對考馬斯亮藍法測定5 mg/ml蛋白質濃度的動態影響

2.2 不同溫度處理下25 mg/ml蛋白質濃度動態變化 當蛋白質濃度為25 mg/ml時(表2)，在溫度為0℃時，蛋白質濃度測定值為20.13 μg/ml，與標準蛋白濃度比誤差百分比為19.47%。當溫度為10℃時，蛋白質濃度測定值仍較低，與標準蛋白濃度比誤差百分比達到28.84%;當溫度為20～30℃時，蛋白質濃度測定值顯著升高，與標準蛋白濃度比誤差百分比為9.65% ～11.24%;當溫度為40～50℃時，蛋白質濃度測定值顯著降低，與標準蛋白濃度比誤差百分比為8.78% ～12.4%。此外，隨著蛋白質與染料孵育時間延長，0～10℃時蛋白質濃度測定值顯著降低、誤差百分比顯著增加，20℃時蛋白質濃度測定值降低、誤差百分比出現先降低后增加的趨勢，在30 min孵育時最接近標準蛋白濃度誤差百分比僅為0.35%，30～50℃時蛋白質濃度測定值急劇下降、誤差百分比顯著增加，其中40和50℃孵育30 min后蛋白質濃度超出分光光度計測定范圍。

2.3 不同溫度處理下50 mg/ml蛋白質濃度動態變化 當蛋白質濃度為50 mg/ml時(表3)，在溫度為0℃時，蛋白質濃度測定值為52.52 μg/ml，與標準蛋白質濃度比誤差百分比為5.04%。當溫度為10℃時，蛋白質濃度測定值最接近標準蛋白濃度，與標準蛋白質濃度比誤差為2.02%。當溫度為20℃時，蛋白質濃度測定值升高，與標準蛋白濃度比誤差百分比為3.91%。當溫度為30～50℃時，蛋白質濃度測定值顯著降低，與標準蛋白濃度比誤差百分比在3.98% ～5.09%間波動。此外，隨著蛋白質與染料孵育時間的延長，0～10℃和30～50℃時蛋白質濃度測定值顯著下降、誤差百分比顯著增加，其中40和50℃孵育30 min后蛋白質濃度超出分光光度計測定范圍。20℃時蛋白質濃度測定值隨著孵育時間延長出現下降，但在孵育30 min時蛋白質濃度測定值最接近標準蛋白濃度，誤差百分比為0.22%，此后誤差百分比又逐漸升高。

表3 不同溫度對考馬斯亮藍法測定50 mg/ml蛋白質濃度的動態影響

2.4 不同溫度處理下75 mg/ml蛋白質濃度動態變化 當蛋白質濃度為75 mg/ml時(表4)，在0～50℃溫度時，蛋白質濃度測定值與標準蛋白濃度比誤差百分比在0.48% ～2.80%間波動，其中40℃時最接近標準蛋白濃度。隨著蛋白質與染料孵育時間延長，0～10℃和30～50℃時蛋白質濃度測定值顯著下降、誤差百分比顯著增加，其中40℃孵育30 min和50℃孵育20 min后蛋白質濃度超出分光光度計測定范圍。20℃時蛋白質濃度測定值隨著孵育時間延長出現下降，但在孵育20 min時蛋白質濃度測定值最接近標準蛋白濃度，誤差百分比為1.13%，此后誤差百分比又逐漸升高。

表4 不同溫度對考馬斯亮藍法測定75 mg/ml蛋白質濃度的動態影響

2.5 不同溫度處理下100 mg/ml蛋白質濃度動態變化 當蛋白質濃度為100 mg/ml時(表5)，在0～50℃溫度時，蛋白質濃度測定值與標準蛋白濃度比誤差百分比在3.97% ～5.79%間波動，其中10℃時最接近標準蛋白濃度。隨著蛋白質與染料孵育時間延長，0～10℃和30～50℃時蛋白質濃度測定值顯著下降、誤差百分比顯著增加，其中40℃孵育30 min和50℃孵育20 min后蛋白質濃度超出分光光度計測定范圍。20℃時蛋白質濃度測定值孵育0～20 min間比較穩定，孵育30 min時蛋白質濃度測定值下降但最接近標準蛋白濃度，誤差百分比為2.18%，此后蛋白質濃度測定值和誤差百分比又顯著升高。

表5 不同溫度對考馬斯亮藍法測定100 mg/ml蛋白質濃度的動態影響

3 討論

考馬斯亮藍法已經廣泛應用于各種生物材料的蛋白質含量測定，被眾多科研工作者認為是一種傳統的、穩定的和可靠的蛋白質測定方法。但該論文研究發現，溫度、測定蛋白質濃度以及測定有效時間等影響因子都決定考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度的精度以及后續蛋白質研究的準確程度。

從溫度變化效應來看，無論蛋白質濃度高低，0～10℃低溫組和30～50℃高溫組考馬斯亮藍法測定的蛋白質濃度與標準蛋白濃度比較均有顯著差異，20℃時測定的蛋白質濃度與標準蛋白濃度比較均差異最小。從蛋白質濃度效應來看，在該研究建立的蛋白質測定范圍內(0～100 mg/ml)，蛋白質濃度較低組(如5 mg/ml)采用考馬斯亮藍法測定結果極不穩定且誤差率極大，而蛋白質濃度越高考馬斯亮藍法測定的蛋白質濃度與標準蛋白濃度相比越穩定，同時蛋白質濃度越高對溫度變化引起的影響越小，其中蛋白質濃度在25～100 mg/ml各組中，20℃時考馬斯亮藍法測定的蛋白質濃度與標準蛋白濃相比差異最小。從測定時間效應來看，在0～10℃低溫組中考馬斯亮藍法測定的蛋白質濃度隨著孵育時間延長與標準蛋白濃度比較差異顯著，在30～50℃高溫組中考馬斯亮藍法測定的蛋白質濃度隨著孵育時間延長與標準蛋白濃度比較差異極顯著，尤其是在40～50℃高溫時各濃度蛋白質孵育至30～40 min后超出分光光度計檢測范圍，但在20℃時測定的蛋白質濃度在孵育0～30 min過程中表現穩定，尤其是孵育20～30 min后蛋白質濃度與標準蛋白濃度比較均差異最小。

通過對考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度的諸多影響因素的研究，得出最優化試驗方案，在0～100 mg/ml蛋白質濃度標準曲線測定范圍內，20℃是考馬斯亮藍染料最適溫度，因此在測定蛋白質濃度過程中表現出穩定的結果，但是20℃時反應最佳時間在孵育20～30 min后才表現出來，推測考馬斯亮藍染料與蛋白質結合需要一定的時間才能達到最佳效果。同時待檢測蛋白質濃度越高，考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度過程中對各種因素影響的抵御能力越強，推測是較高濃度的蛋白質對考馬斯亮藍染料保護性較強，對外界環境影響具有較好的抵御能力，所以在蛋白質濃度測定中表現出穩定的結果。

綜上所述，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度時，要注意試驗環境溫度、待測樣品濃度范圍以及染料與蛋白質孵育時間等互作效應，合理優化測定方案，旨在充分利用考馬斯亮藍法的優點準確測定蛋白質濃度，為進一步研究蛋白質性質和功能提供科學依據。

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