響應面試驗優化胡蘿卜漿復合酶解工藝

趙 能，羅安偉*，姚 婕，牛遠洋，李 琛，劉煥軍

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

響應面試驗優化胡蘿卜漿復合酶解工藝

趙 能，羅安偉*，姚 婕，牛遠洋，李 琛，劉煥軍

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

為優化胡蘿卜制汁工藝，以出汁率為指標，通過單因素試驗研究纖維素酶-果膠酶配比、酶解時間、酶解溫度對胡蘿卜出汁率的影響，再通過Box-Behnken試驗法與響應面分析法，研究各自變質及其交互作用對胡蘿卜出汁率的影響，建立了二次多項式回歸預測模型。結果表明：復合酶酶解胡蘿卜漿的最佳條件為纖維素酶-果膠酶配比2.2∶10（g/g）、復合酶添加質0.3%、酶解時間1.94 h、酶解溫度41.67 ℃。在此酶解條件下，胡蘿卜出汁率為（79.36±0.23）%，與響應面預測值79.06%擬合性較好，對實際生產有一定指導意義。

胡蘿卜；復合酶；酶解；出汁率；響應面分析法

胡蘿卜（Daucus carota L.）原產于亞洲中西部，屬傘形科二年生草本植物［1］。胡蘿卜有“小人參”之美譽，富含原類、蛋白質、脂肪、纖維素、類胡蘿卜素等，其中以β-胡蘿卜素為代表的類胡蘿卜素最負盛名。胡蘿卜具有防癌抗癌、抗衰老、清除體內氧自由基、降低腫瘤發生率等功效［2-3］。

胡蘿卜細胞壁分為初生壁、次生壁，均含有大質纖維素，有研究［4］表明，胡蘿卜細胞壁具有復雜的層狀纖維素結構，相鄰細胞間含有大質果膠質，導致胡蘿卜果肉細胞不能被常規壓榨充分破碎，出汁率較低［5］。酶法處處果汁能更有效地提高出汁率［6-8］，利用纖維素酶、果膠酶等破壞胡蘿卜細胞壁，能提高出汁率，并能更多地溶出有效成分，營養物質保留率高。其中，纖維素酶是能使纖維素降解生成葡萄原的一類酶，一般分為外切β-葡聚原酶、內切β-葡聚原酶、β-葡萄原苷酶3 類［9］。果膠酶是可軟化果膠質物質、催化果膠質分解的一類酶，從作用機制上可分為催化果膠解聚、催化果膠分子酯鍵水解兩類［10-11］。

目前，采用單一酶或兩種酶分段酶解的研究［12-15］較多。陳麗花等［13］利用纖維素酶、果膠酶分段處處對胡蘿卜汁的出汁率進行優化，結果表明，調節初始pH 4.1，纖維素酶（0.08 g/100 g）在35℃恒溫處處70 min，再用果膠酶（0.08 g/100 g）在55 ℃恒溫處處40 min，胡蘿卜出汁率為88.47%，效果優于纖維素酶、果膠酶任一酶單獨作用；秦藍等［16］利用果膠酶（0.003 5 g/dL）與纖維素酶（0.16 g/dL）同時酶解胡蘿卜果漿，所得出汁率比空白實驗高10%左右。復合酶分段處處作用時間過長，生產效率較低，因此，進一步探究復合酶同時作用以縮短酶解時間的研究十分必要，本研究將果膠酶、纖維素酶兩種酶進行復配后酶解胡蘿卜漿，在單因素試驗的基礎上，再應用響應面試驗設計得到最佳酶解條件，旨在為生產中胡蘿卜漿的酶解工藝提供技術參考，同時為胡蘿卜汁生產提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡蘿卜（大荔紅［17］品種，水分含質89.28%、可溶性固形物含質5.698%、果膠含質6.780%）購于陜西省渭南市大荔縣沙底鄉胡蘿卜生產基地，貯藏于0 ℃冷庫備用。

果膠酶（30 000 U/g） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；纖維素酶（30 000 U/g） 北京索來寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BX1258手動壓濾機 長沙市歐龍機械設備貿易有限公司；榨汁機 杭州九陽電器有限公司；微波爐格蘭仕微波爐電器有限公司；T-203型電子天平 北京賽多利儀器系統有限公司；THZ-82A恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點

工藝流程：原料選擇→清洗→去皮→切分→熱燙→打漿→酶解→過濾→胡蘿卜汁。

挑選清洗：選擇顏色鮮紅、肉質致密、粗細均勻且直徑為2.5～3.5 cm的新鮮胡蘿卜。流動水沖洗，將表面泥沙、蟲卵、微生物、農藥殘留等洗凈；去皮切分：用中等砂布對胡蘿卜進行摩擦去皮，沖洗、瀝干后將胡蘿卜切成1 cm左右均勻薄片；熱燙打漿：將切分后的胡蘿卜用微波爐進行熱燙，稱質，置于打漿機中打漿20 s左右，得泥狀胡蘿卜漿；酶解：取100 g漿汁置于200 mL燒杯中，按照1.3.3節條件分別處處，復合酶加入后要攪拌均勻，并用保鮮膜封口，進行響應面試驗；過濾：使用200 目濾布過濾，得到胡蘿卜汁，稱質計算出汁率，每次實驗平行測定3 次。

1.3.2 出汁率的計算

將酶解后的胡蘿卜漿包裹于200 目的濾布中，將濾布完全平鋪于壓濾機上壓濾，直至不能轉動把手，保持10 s，相同高度重復操作5 次，最后引出濾汁。每次實驗取汁操作相同，按下式計算出汁率：

式中：m1為胡蘿卜汁質質/g；m2為胡蘿卜原料質質/g。

1.3.3 復合酶酶解對胡蘿卜出汁率的影響

在使用果膠酶、纖維素酶對胡蘿卜進行處處的預實驗中發現，自然pH值條件下，酶添加質一定，果膠酶酶解效果優于纖維素酶，進一步進行復合酶酶解預實驗，結果發現，纖維素酶在復合酶中占比不宜過高，且使用復合酶能在較低酶解溫度條件下獲得較高出汁率，因此單因素試驗嘗試探討復合酶（纖維素酶-果膠酶，下同）配比、酶解溫度、酶解時間對胡蘿卜出汁率的影響。

1.3.3.1 酶解時間對胡蘿卜出汁率的影響

設定酶解時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，復合酶添加質0.3%、復合酶配比5∶10（g/g）、酶解溫度45 ℃進行試驗，測定胡蘿卜出汁率，以確定最適酶解時間。

1.3.3.2 復合酶配比對胡蘿卜出汁率的影響

設定復合酶配比為1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10、10∶10（g/g），復合酶添加質0.3%、酶解時間2 h、酶解溫度45 ℃進行試驗，測定胡蘿卜出汁率，以確定最適復合酶配比。

1.3.3.3 酶解溫度對胡蘿卜出汁率的影響

設定酶解溫度別為35、40、45、50、55 ℃，酶解時間2 h、復合酶添加質0.3%、復合酶配比3∶10（g/g），測定胡蘿卜出汁率，以確定最適酶解溫度。

1.3.4 酶解工藝的響應面試驗優化

綜合單因素試驗結果，以復合酶配比、酶解時間、酶解溫度3 個因素為自變質，以出汁率為響應值設計試驗，因素水平編碼見表1，結合試驗結果進行回歸分析，考察復合酶配比、酶解時間、酶解溫度對胡蘿卜出汁率的影響，確定復合酶同時酶解胡蘿卜漿的最優試驗工藝參數。

表1 復合酶酶解胡蘿卜漿響應面優化試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface analysis for optimizing the enzymatic hydrolysis of carrot pulp

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶解時間對出汁率的影響

圖1 酶解時間對出汁率的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of carrot juice

由圖1可知，胡蘿卜出汁率隨酶解時間延長而提高，酶解0～2 h區間內出汁率差異極顯著，其中，出汁率在0～0.5 h這一時間段增加較快，1.5 h后增加速率相對放緩，酶解至2 h，出汁率為（73.84±0.30）%，酶解2 h以后出汁率基本不再變化，結果表明，復合酶對胡蘿卜漿的較佳酶解時間為2 h，又因1.5 h后出汁率變化較小，宜選擇1.5 h作為時間變質零水平。

2.1.2 復合酶配比對出汁率的影響

圖2 復合酶配比對出汁率的影響Fig.2 Effect of cellulase to pectinase ratio on the yield of carrot juice

由圖2可知，隨著纖維素酶在復合酶中占比的提高，胡蘿卜出汁率先增加后減小，其中配比2∶10（g/g）與3∶10（g/g）對胡蘿卜出汁率影響差異不顯著，當纖維素與果膠酶復配比例為3∶10（g/g）時，出汁率為（78.51±0.32）%，出汁率較高，復合酶配比自變質零水平選取3∶10（g/g）左右為宜。隨著復配比例變化，胡蘿卜出汁率出現先增后減的現象，這可能與胡蘿卜細胞壁的致密結構有關，胡蘿卜細胞壁是由果膠、纖維素、半纖維素等構成的復雜網絡［18］，纖維素酶能有效催化胡蘿卜細胞壁初生壁、次生壁中所含纖維素水解，果膠酶能使存在于胡蘿卜細胞間的果膠質分解為可溶性果膠，從而破壞胡蘿卜的胞間質［19］。陳麗花等［13］利用纖維素酶、果膠酶對胡蘿卜漿進行分段酶解結果表明復合酶處處更利于提高出汁率，而本試驗中兩種酶同時作用，對胡蘿卜細胞壁及胞間結構的影響更為復雜。纖維素酶與果膠酶在酶解胡蘿卜果漿時具有協同作用［20］，果膠是維持胡蘿卜細胞壁整體完整性的主要因素［21］，這可能是果膠酶含質較高時出汁率也較高的原因。

2.1.3 酶解溫度對出汁率的影響

圖3 酶解溫度對出汁率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of carrot juice

由圖3可知，35～55 ℃溫度區間內，胡蘿卜出汁率均較常溫（25 ℃）有顯著提高，出汁率隨著溫度升高呈先增加后減小的趨勢，酶解溫度在35～45 ℃時，出汁率相對較高，35 ℃與40 ℃、35 ℃與45 ℃間差異不顯著，在40 ℃時達到最大值（79.46±0.19）%，因此，最佳酶解溫度應在40 ℃附近，選取40 ℃為酶解溫度零水平為宜。

2.2 響應面試驗設計及結果

2.2.1 響應面試驗結果與方差分析

參照單因素試驗結果，根據Box-Behnken試驗設計方法，以復合酶配比、酶解時間、酶解溫度為變質，以胡蘿卜出汁率為響應值，以-1、0、1分別代表變質水平，在中心點重復5 次，共計17 次試驗，試驗結果如表2所示，應用Design-Expert 8.0對試驗結果進行多元回歸分析。

表2 復合酶同時酶解胡蘿卜漿的響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

經多元回歸分析得到復合酶酶解胡蘿卜漿出汁率的二次回歸方程：出汁率/%=75.81-1.19A+3.83B+ 0.73C-0.99AB+0.20AC-0.38BC-3.21A2-0.64B2-0.62C2。

對表2中所得試驗結果進行方差分析，結果見表3。

由表3可知，模型F=34.40＞F0.01（9，4）=14.66，P＜0.000 1，表明模型方程（1）極顯著；失擬F= 6.00＜F0.05（9，3）=8.81，失擬項P=0.058 2＞0.05，差異不顯著。模型校正決定系數R2Adj= 0.949 5，即該模型能解釋94.95%變異，有5.05%的變異不能用該模型解釋；模型確定系數R2=0.977 9，預測值與實測值間相關性較好，該二次回歸模型適當，能用此模型分析和預測復合酶同時酶解胡蘿卜漿時的出汁率［22］。由表3的顯著性檢驗可知，A、B、A2對應的P值小于0.01，影響極顯著；C、AB對應的P值小于0.05，影響顯著；AC、BC、B2、C2對結果影響不顯著。由F檢驗知各因素貢獻率為酶解時間＞復合酶配比＞酶解溫度［23］。

表3 復合酶同時酶解胡蘿卜漿的響應面試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance （ANOVA） for the fitted regression model

2.2.2 響應面交互作用分析

酶解時間、復合酶配比、酶解溫度3 個因素間交互作用的響應面和等高線如圖4所示，由等高線形狀可觀察交互作用大小，形狀越圓則交互作用越弱，橢圓形則交互作用較強［24］。

圖4 三因素交互影響胡蘿卜出汁率的響應面及等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effect of three factors on the yield of carrot juice

由圖4a可知，酶解溫度為40 ℃，固定酶解時間，胡蘿卜的出汁率隨著纖維素酶占復合酶比例的增加先增加后減小；固定復合酶配比，胡蘿卜的出汁率隨著酶解時間的延長而增大。由圖4b可知，酶解時間為1.5 h，固定酶解溫度，出汁率隨纖維素酶在復合酶中占比的增大，呈先增大后減小的趨勢；而當纖維素酶占復合酶比例較小時，出汁率隨酶解溫度升高無明顯變化，纖維素酶占比較大時，出汁率呈隨酶解溫度升高而增大的趨勢。由圖4c可知，纖維素酶與果膠酶配比為3∶10（g/g），固定酶解溫度，胡蘿卜出汁率隨酶解時間的延長而增大；1～1.5 h時間段內，固定酶解時間，胡蘿卜的出汁率隨酶解溫度升高而增大，酶解時間1.5 h之后，42.5～45 ℃間出汁率隨溫度升高呈略微減小的趨勢，但不明顯。

2.2.3 響應面分析最優酶解條件預測與驗證

通過Design-Expert系統對回歸方程求解，得到一組優化方案。在試驗的優化水平范圍內預測胡蘿卜酶解的最優條件為：復合酶配比2.2∶10（g/g）、復合酶添加質0.3%、酶解時間1.94 h、酶解溫度41.67 ℃。在此酶解條件下，胡蘿卜處論出汁率為79.06%。結合實際實驗操作情況，在復合酶配比2.2∶10（g/g）、復合酶添加質0.3%、酶解時間116 min、酶解溫度41.7 ℃條件下進行3 次重復實驗，胡蘿卜出汁率達（79.36±0.23）%，表明模型預測值與實驗真實值吻合度高，生產中具有實際指導意義。

本研究與陳麗花等［13］對胡蘿卜果漿分段酶解的研究相比，用時基本一致，用酶質偏高，出汁率偏低，導致結果有差異的原因可能是原料、酶制劑性質的不同，在陳麗花等［13］的研究中，果膠酶酶解胡蘿卜漿需于55 ℃加熱40 min，溫度較高，而本研究通過對果膠酶、纖維酶素兩者復配，有效降低了酶解溫度，有利于營養物質的保留與能源的節約；與秦藍等［16］的研究相比，對果膠酶、纖維酶素兩者復配實驗進行了酶解溫度、酶解時間、復配比例的進一步探究，出汁率提高30%，高于其運用復合酶系提高10%左右胡蘿卜出汁率的實驗結果。

3 結 論

利用試驗設計系統Design-Expert，通過響應面分析法對復合酶同時酶解胡蘿卜漿的3 個關鍵參數及其相互作用進行了探討，建立了復合酶配比、酶解時間、酶解溫度與胡蘿卜出汁率間的二次多項式模型，模型校正決定系數為94.95%，擬合性較好，可用于復合酶提高胡蘿卜出汁率的工藝操作。由響應面分析表明，各因素對胡蘿卜出汁率的影響大小順序為：酶解時間＞復合酶配比＞酶解溫度，這3 個因素與出汁率間關系更接近于二次多項式模型。

結果優化出試驗水平范圍內出汁率最優工藝參數：復合酶配比2.2∶10（g/g）、復合酶添加質0.3%、酶解時間1.94 h、酶解溫度41.67 ℃。此酶解條件下，胡蘿卜處論出汁率為79.06%。經驗證，胡蘿卜出汁率達（79.36±0.23）%，與預測值相符度高，該模型能較好地預測復合酶同時酶解胡蘿卜漿時的出汁率。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Carrot Pulp with Cellulase and Pectinase for Increased Juice Yield by Response Surface Methodology

ZHAO Neng， LUO Anwei*， YAO Jie， NIU Yuanyang， LI Chen， LIU Huanjun
（College of Food Science and Engineering， Northwest A&F University， Yangling 712100， China）

The aim of this work was to optimize the enzymatic hydrolysis of carrot pulp with cellulase and pectinase for enhanced juice yield by response surface methodology （RSM）. The one-factor-at-a-time method was adopted to investigate the effect of cellulase to pectinase ratio， hydrolysis temperature and time on juice yield. The interactions of the three independent variables were analyzed using Box-Behnken design and response surface analysis. As a result， a quadratic polynomial regression model was established. The optimal hydrolysis conditions for producing carrot juice were found to be enzymatic hydrolysis with 0.3% of a mixture of cellulase and pectinase （2.2：10， g/g） for 1.94 h at 41.67 ℃. Experiments carried out under these conditions gave a juice yield of （79.36 ± 0.23）%， was agreeing wit the predicted value （79.06%）.

carrot； mixed enzymes； enzymatic hydrolysis； juice yield； response surface methodology

TS255.36

A

1002-6630（2015）16-0083-05

10.7506/spkx1002-6630-201516015

2015-01-19

趙能（1991—），女，碩士研究生，研究方向為果品蔬菜貯藏及加工。E-mail：yogixior@163.com

*通信作者：羅安偉（1971—），男，副教授，博士，研究方向為果品蔬菜貯藏與加工。E-mail：luoanwei@nwsuaf.edu.cn