新疆和內(nèi)蒙古地區(qū)油葵舌狀花中全反式葉黃素含量的分析

惠伯棣，宮 平

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院食品科學(xué)系，北京 100191）

新疆和內(nèi)蒙古地區(qū)油葵舌狀花中全反式葉黃素含量的分析

惠伯棣，宮 平

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院食品科學(xué)系，北京 100191）

檢測(cè)我國(guó)新疆（樣品Ⅰ）和內(nèi)蒙古（樣品Ⅱ）地區(qū)油葵舌狀花樣品中的全反式葉黃素含量，以評(píng)價(jià)其作為葉黃素新資源的可能性，并為提高當(dāng)?shù)赜涂a(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)附加值提供相對(duì)含量測(cè)定的依據(jù)。結(jié)果表明：樣品Ⅰ和Ⅱ全反式葉黃素含量（以樣品干質(zhì)量計(jì)算）分別為1.5‰和0.8‰。該油葵舌狀花中的葉黃素可考慮作為葉黃素潛在的新資源。

葵花；舌狀花；類(lèi)胡蘿卜素；葉黃素；C18-高效液相色譜；C30-高效液相色譜

葵花（Helianthus annuus L.）又稱(chēng)向日葵、西番菊、太陽(yáng)花等，屬菊科，為一年生草本植物，起源于北美，現(xiàn)有52 個(gè)品種[1]。該植物在我國(guó)東北、華北和西北的新疆、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙、山西、黑龍江、吉林等地被作為農(nóng)作物大面積種植。尤其在我國(guó)的新疆和內(nèi)蒙古地區(qū)，葵花的種植在當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)業(yè)和產(chǎn)業(yè)中已經(jīng)占有重要的比重。在內(nèi)蒙古中東部地區(qū)，常年種植面積便有幾十萬(wàn)畝。在新疆地區(qū)，常年種植面積已有近200萬(wàn) 畝。按加工用途劃分，栽培葵花可作為油料作物（又稱(chēng)油葵）、食用作物（又稱(chēng)食葵）和觀賞植物（又稱(chēng)花葵）[1-2]。油葵已經(jīng)成為我國(guó)第三大油料作物。除舌狀花（又稱(chēng)花舌）外，葵花（包括油葵和食葵）植株的全身均已被加工利用。同時(shí)，葵花全草皆可入藥，花舌可祛風(fēng)明目[1]。

葵花的花舌即是其頭狀花序外周的舌狀花，以黃色、橙色多見(jiàn)。其中主要色素為脂溶性的類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)物質(zhì)，主要為葉黃素類(lèi)化合物。其中的葉黃素類(lèi)化合物與脂肪酸酯化，以酯的形式存在[3]。葉黃素類(lèi)化合物含有雙羥基，以葉黃素、玉米黃素最為常見(jiàn)。二者互為幾何異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1[4-6]。目前已知葉黃素和玉米黃素均為黃斑色素。大量補(bǔ)充二者均可降低黃班衰退癥的風(fēng)險(xiǎn)，并對(duì)視網(wǎng)膜有保護(hù)作用。二者都具有優(yōu)秀的單線態(tài)氧淬滅能力。因此，這2 種化合物對(duì)人體健康均有著積極影響[7-10]。

圖1 葉黃素（A）和玉米黃素（B）結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of lutein （A） and zeaxanthin （B）

目前，生產(chǎn)天然葉黃素的主要原料是萬(wàn)壽菊（Tagetes erecta）的花。天然玉米黃素的理想資源是枸杞果實(shí)。作為羥基類(lèi)胡蘿卜素的天然資源，萬(wàn)壽菊與枸杞二者均為栽培作物，其生產(chǎn)均占用農(nóng)業(yè)資源。本研究的目的是對(duì)油葵舌狀花中的全反式黃色素進(jìn)行定量分析。預(yù)期結(jié)果將對(duì)評(píng)價(jià)油葵舌狀花中的葉黃素資源有一定的參考價(jià)值。這一努力對(duì)開(kāi)發(fā)葉黃素類(lèi)物質(zhì)新資源和提高葵花產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)附加值具有現(xiàn)實(shí)的意義。

1 材料與方法

1.1 樣品

舌狀花樣品Ⅰ采集自新疆伊犁-阿勒泰地區(qū)，樣品Ⅱ采集自?xún)?nèi)蒙包頭市固陽(yáng)地區(qū)。每個(gè)樣品采收地面積6 670 m2以上，品種統(tǒng)一，采收時(shí)間為種子收獲期前15 d。干燥方法：70 ℃條件下常壓干燥至質(zhì)量恒定。樣品最終含水量小于15%。樣品采集方法設(shè)計(jì)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，以保障結(jié)果具有代表性。

1.2 試劑

葉黃素參比樣品（C/N：0133，純度96%，包裝規(guī)格為5 mg/瓶）、（3R, 3’R）玉米黃素參比樣品（C/ N：0119），純度97%，包裝規(guī)格為5 mg/瓶） 瑞士CaroNature公司；正己烷、95%乙醇、KOH和NaCl（均為分析純） 北京化工廠；乙腈、乙酸乙酯、甲醇和甲基叔丁基醚（均為色譜純） 美國(guó)迪馬公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Multispec-1501紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；C18色譜柱為DiamondsTMDikma Technologies（4.6 mm×250 mm，5 μm）；C30色譜柱為YMCTMCarotenoid（4.6 mm×250 mm，5 μm）；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、PU-2080 Plus流動(dòng)相輸送系統(tǒng)、UV-2075紫外檢測(cè)器 日本Jasco公司。

1.4 方法

1.4.1 總類(lèi)胡蘿卜素萃取

將干燥的油葵舌狀花用咖啡磨粉碎，過(guò)40 目篩。準(zhǔn)確（精確至0.000 1 g）稱(chēng)取0.5 g粉末于研缽中，用10 mL正己烷研磨萃取。適時(shí)用滴管將上清液取出、收集。重復(fù)萃取6 次，至上清液無(wú)色。合并萃取液，定容于50 mL棕色容量瓶中。定容液直接用于C18-HPLC檢測(cè)。定容液稀釋10 倍后用于紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)。每個(gè)樣品做平行樣6 份，結(jié)果取平均值。

1.4.2 皂化制備游離態(tài)葉黃素

將萃取液按1∶1體積比加入10%的KOH-乙醇溶液進(jìn)行皂化。皂化條件：避光、充氮、室溫、慢速磁力攪拌。反應(yīng)2 h后，按1∶1體積比加入5%的NaCl溶液，緩慢搖動(dòng)后靜置，待出現(xiàn)分層后收集上相，下相用25 mL正己烷萃取2～3 次，直到無(wú)色。將上相與萃取液合并，定容于50 mL棕色容量瓶中。定容體積超出刻度時(shí)用氮?dú)獯抵量潭取６ㄈ菀河糜贑18-HPLC、C30-HPLC檢測(cè)，稀釋10 倍后用于UV-VIS檢測(cè)。

1.4.3 葉黃素類(lèi)化合物的檢測(cè)

取皂化前樣品用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)在450 nm波長(zhǎng)處以正己烷為參比測(cè)定樣品的吸光度，根據(jù)Beer-Lambert定律，按公式（1）計(jì)算樣品液中總類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量：

式中：A為450nm波長(zhǎng)處的吸光度；V為樣品體積/mL；MTCA為總類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量/mg。

根據(jù)樣品質(zhì)量（0.5 g）計(jì)算樣品中總類(lèi)胡蘿卜素含量，以干質(zhì)量計(jì)算。取皂化后樣品用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)在450 nm波長(zhǎng)處以正己烷為參比比色，根據(jù)式（1）計(jì)算樣品中游離態(tài)總類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量。根據(jù)樣品質(zhì)量（0.5 g）計(jì)算樣品中游離態(tài)總類(lèi)胡蘿卜素含量，以干質(zhì)量計(jì)算。

根據(jù)皂化前后結(jié)果按式（2）計(jì)算皂化損失率：

式中：L為皂化損失率/%；A前為皂化前吸光度；A后為皂化后吸光度。

C18-HPLC檢測(cè)皂化前后樣品中的類(lèi)胡蘿卜素組成。色譜條件：色譜柱為DiamonsilTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈-水（9∶1，V/V）；流動(dòng)相B為乙酸乙酯；梯度洗脫：20 min內(nèi)，流動(dòng)相B由0%上升到100%，之后5 min流動(dòng)相B保持100%；檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL[11-12]。根據(jù)色譜圖上組分的保留時(shí)間與參比樣品的比較定性葉黃素-玉米黃素組分，并根據(jù)色譜圖上各組分峰面積計(jì)算葉黃素-玉米黃素組分相對(duì)含量。按式（3）計(jì)算樣品中游離態(tài)葉黃素-玉米黃素組分質(zhì)量：

式中：m1為樣品中游離態(tài)葉黃素-玉米黃素組分質(zhì)量；m2為樣品中游離態(tài)總類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量（紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)）；m3為樣品中游離葉黃素-玉米黃素組分相對(duì)含量（C18-HPLC檢測(cè)）。

根據(jù)樣品質(zhì)量（0.5 g）計(jì)算樣品中游離態(tài)葉黃素-玉米黃素組分含量，以千分單位計(jì)。

比較樣品皂化前后的C18-HPLC色譜圖。計(jì)算皂化后消失的類(lèi)胡蘿卜素酯組分峰面積之和，按式（4）計(jì)算樣品中總類(lèi)胡蘿卜素酯相對(duì)含量。

式中：M為總類(lèi)胡蘿卜素酯組分相對(duì)含量；A1為類(lèi)胡蘿卜素酯組分峰面積；A2為類(lèi)胡蘿卜素組分峰面積。

C30-HPLC檢測(cè)皂化后葉黃素的幾何異構(gòu)體組成。色譜柱為YMCTMCarotenoid（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈-甲醇（3∶1，V/V）；流動(dòng)相B為甲基叔丁基醚；梯度洗脫：20 min內(nèi)，流動(dòng)相B由0%上升到55%，之后10 min流動(dòng)相B保持55%；檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL[4,13-17]。根據(jù)色譜圖上組分的保留時(shí)間與參比樣品的比較定性全反式葉黃素、玉米黃素及其幾何異構(gòu)體組分，并根據(jù)色譜圖上全反式葉黃素、玉米黃素及其順式異構(gòu)體組分峰面積，計(jì)算全反式葉黃素組分相對(duì)含量。按式（5）計(jì)算樣品中全反式葉黃素質(zhì)量：

式中：m全為樣品中全反式葉黃素組分含量；m0為樣品中葉黃素-玉米黃素組分含量（C18-HPLC）；m相對(duì)為樣品中全反式葉黃素組分相對(duì)含量（C30-HPLC）；根據(jù)樣品質(zhì)量（0.5 g）計(jì)算樣品中全反式葉黃素組分含量，以千分單位計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 舌狀花中總類(lèi)胡蘿卜素含量

皂化前每個(gè)樣品在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按式（1）計(jì)算其總類(lèi)胡蘿卜素含量分別為（樣品Ⅰ）4.3‰和（樣品Ⅱ）2.2‰。

2.2 舌狀花中總游離態(tài)類(lèi)胡蘿卜素含量

皂化后每個(gè)樣品在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度按式（1）計(jì)算樣品總游離態(tài)類(lèi)胡蘿卜素含量分別為（樣品Ⅰ）2.8‰和（樣品Ⅱ）1.5‰。

與皂化前樣品的吸光度比較，按式（2）計(jì)算，每個(gè)樣品的皂化損失率分別為35%和34%。

2.3 舌狀花中總類(lèi)胡蘿卜素酯含量

圖2為樣品Ⅰ皂化前、后的C18-HPLC色譜圖。皂化前樣品C18-HPLC色譜圖中，保留時(shí)間為8.32 min的組分為葉黃素，保留時(shí)間為11.58、17.41、18.11、18.68 min的組分在皂化后消失。其中11.58 min的組分為葉黃素單酯可能性較大，17.41、18.11、18.68 min的組分為葉黃素雙酯可能性較大[3]。根據(jù)各組分峰面積，按式（4）計(jì)算其峰面積之和占總峰面積的比例，樣品Ⅰ為64%，樣品Ⅱ?yàn)?1%。故二者的總類(lèi)胡蘿卜素酯含量分別為（樣品Ⅰ）2.6‰和（樣品Ⅱ）1.3‰。

圖2 葵花舌狀花正己烷萃取物皂化前（A）和皂化后（B）的C1188-HHPPLLCC圖Fig.2 C18-HPLC profiles of hexane extract from the ray florets of sunflower before （A） and after （B） saponification

2.4 葉黃素-玉米黃素組分含量

圖3 全反式葉黃素參比樣品CC1188-HPPLLCC圖Fig.3 C18-HPLC profile of all E-lutein

圖3 為葉黃素參比樣品C18-HPLC色譜圖。皂化后樣品C18-HPLC色譜圖中保留時(shí)間為8.30 min的組分與葉黃素參比樣品8.25 min的組分保留時(shí)間基本一致。據(jù)此，定性該組分為葉黃素-玉米黃素組分。

根據(jù)圖2峰面積，計(jì)算葉黃素-玉米黃素組分的相對(duì)比例。樣品Ⅰ中葉黃素-玉米黃素組分占總峰面積的60%，樣品II中葉黃素-玉米黃素組分占總峰面積的62%。按式（3）計(jì)算，樣品Ⅰ中葉黃素-玉米黃素組分的含量為1.7‰，樣品Ⅱ中葉黃素-玉米黃素組分的含量為0.9‰。

2.5 舌狀花中全反式葉黃素組分含量

圖4 全反式葉黃素（A）和玉米黃素（B）參比樣品CC3300-HPPLLCC圖Fig.4 C30-HPLC profiles of all E-lutein （A） and E-zeaxanthin （B）

由圖4可見(jiàn)，保留時(shí)間為12.92 min的組分為全反式葉黃素，保留時(shí)間為14.23 min的組分為全反式玉米黃素。

圖5 油料葵花正己烷提取物皂化后CC3300-HHPPLLCC圖Fig.5 C30-HPLC profile of hexane extract from the ray florets of sunflower after saponification

樣品Ⅰ皂化后的C30-HPLC色譜圖見(jiàn)圖5。保留時(shí)間為12.94 min的組分與全反式葉黃素參比樣品中12.92 min的保留時(shí)間基本一致，故定性為全反式葉黃素。如圖5所示，樣品除全反式葉黃素外，還存在少量順式葉黃素和玉米黃素組分。根據(jù)色譜圖上全反式葉黃素、玉米黃素及其順式異構(gòu)體組分峰面積，計(jì)算全反式葉黃素組分相對(duì)含量，樣品Ⅰ為88%，樣品Ⅱ?yàn)?6%。全反式玉米黃素相對(duì)含量，樣品Ⅰ為8%，樣品Ⅱ?yàn)?%。按式（5）計(jì)算樣品中全反式葉黃素和玉米黃素組分的質(zhì)量。經(jīng)過(guò)對(duì)樣品的檢測(cè)，樣品中類(lèi)胡蘿卜素（包括葉黃素）的含量見(jiàn)表1。樣品中全反式葉黃素的含量為樣品Ⅰ1.5‰，樣品Ⅱ0.8‰；全反式玉米黃素組分的含量為樣品Ⅰ0.14‰，樣品Ⅱ0.081‰。這一檢測(cè)結(jié)果顯示：樣品中玉米素組分的含量有限，不能做為玉米黃素的天然資源考慮。

表1 樣品中類(lèi)胡蘿卜素含量Table 1 Carotenoid contents in samples‰

3 討 論

在本研究中，樣品采集的廣泛性有限。因此，得到的結(jié)論僅適用于樣品采集地的資源。在今后的工作中，應(yīng)當(dāng)在全國(guó)油葵的各主產(chǎn)區(qū)采集樣品，使樣品采集的方式和方法具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果顯示：伊犁-阿勒泰地區(qū)的油葵舌狀花樣品中全反式葉黃素的含量較內(nèi)蒙包頭固陽(yáng)地區(qū)的較高。其原因可能是多方面的，如環(huán)境和氣候條件差異是一個(gè)重要原因。尤其是日照強(qiáng)度和時(shí)間以及晝夜溫差的差異對(duì)油葵植株的次生代謝會(huì)產(chǎn)生較明顯的影響。

本研究采用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)值為基礎(chǔ)的方法，HPLC檢測(cè)只提供各組分的相對(duì)比例。與直接用參比樣品在C30柱上做外標(biāo)定量的方法相比，這種方法可最大限度地消除皂化、C30色譜柱保留等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成的影響。這種方法已在世界各國(guó)的國(guó)標(biāo)方法中采用。

僅就本研究中采集樣品而言，與萬(wàn)壽菊花中的葉黃素資源相比，其產(chǎn)地的油葵舌狀花中的葉黃素含量是有限的。因此，只有在資源量相當(dāng)豐富，而且成本很低的條件下，二者產(chǎn)地的油葵舌狀花中的葉黃素才能被考慮成為葉黃素的新資源。

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Quantification of the Content of all E-lutein from the Ray Florets of Oil Sunflower in Xinjiang and Inner Mongolia

HUI Bodi， GONG Ping
（Department of Food Science， College of Applied Arts and Science， Beijing Union University， Beijing 100191， China）

This study aimed to determine the content of all E-lutein in the ray fl orets of oil sunfl ower cultured in Xinjiang (Sample Ⅰ) and Inner Mongolia (Sample Ⅱ), China for assessing its potential exploitation as a novel source of lutein. This effort may also form a solid base for increasing the industrial benefi ts of sunfl ower. In practice, the assessment was performed from determination by ultraviolet and visible (UV-VIS) spectroscopy while C18- and C30-high performance liquid chromatography (HPLC) were applied to measure the relative amount of all E-lutein. Data from this assessment suggested that the amounts of all E-lutein in samples Ⅰ and Ⅱ were 1.5‰ and 0.8‰, respectively. The ray fl orets of oil sunfl ower, a plentiful resource, can be considered as a potential source of lutein.

sunfl ower; ray fl oret; carotenoid; lutein; C18-HPLC; C30-HPLC

TS201.2

A

1002-6630（2015）16-0220-04

10.7506/spkx1002-6630-201516041

2014-11-01

惠伯棣（1959—），男，教授，博士，研究方向?yàn)轭?lèi)胡蘿卜素化學(xué)與生物化學(xué)。E-mail：bodi_hui@buu.edu.cn