基于GC-O-MS和AEDA法對清醬肉揮發性風味成分分析

郝寶瑞，張坤生*，張順亮，王守偉，成曉瑜

（1.天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134；2.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

基于GC-O-MS和AEDA法對清醬肉揮發性風味成分分析

郝寶瑞1,2，張坤生1,*，張順亮2，王守偉2，成曉瑜2

（1.天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134；2.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

為探究清醬肉中揮發性風味成分，并分析各個物質對清醬肉整體風味的貢獻大小，采用同時蒸餾萃取提取清醬肉的香氣成分，利用氣相色譜-質譜聯用結合嗅聞儀 分析其揮發性風味成分，共鑒定出61 種化合物，結合芳香萃取物稀釋分析法檢測到的香氣化合物共23 種。清醬肉中檢測到風味活性較強的揮發性物質主要有壬醛（油脂香、香橙香）、3-甲硫基丙醛（煮土豆味）、辛酸乙酯（水果香、甜味）、反-2-壬烯醛（清香）、癸酸乙酯（水果香）、苯乙醛（玫瑰花香），其對清醬肉整體風味貢獻較大。2,4-己二烯酸乙酯（肉香、臘味）是清醬肉 中特有的香氣成分。

清醬肉；揮發性風味成分；同時蒸餾萃取；氣相色譜-質譜聯用結合嗅聞；芳香萃取物稀釋分析法

腌臘肉制品的風味形成是一個復雜的過程，脂質降解、蛋白質降解及碳水化合物發酵是其主要形成途徑[1-2]。風味物質的組成和含質是評價產品整體可接受性的重要指標之一。在目前相關報道中，研究人員大都采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用對產品風味成分分析，檢測到的多種揮發性化合物中，僅一小部分對風味有貢獻[3]，而且有些含質低的有效風味物質對產品的貢獻很大，GC-MS無法將其鑒定出來[4]。因而單純使用GC-MS無法確定各種風味化合物對總體風味貢獻的大小。氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）儀是一種將GC分離能力與人的嗅覺相結合，從復雜的化合物中選擇和評價氣味的有效方法[5]，所以將GC-O和MS連接起來，兩者優勢互補，在揮發性化合物的鑒別和對風味貢獻大小的判斷中發揮更大作用。 芳香萃取物稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）法是GC-O檢測技術中比較常用的一種分析方法，通過逐步稀釋濃縮液，然后對各稀釋梯度的樣品進行GC-O分析，并描述氣味，直到不能聞到氣味為止，計算每種香氣化合物的稀釋因子（flavor dilution factor，FD）值，根據FD值的大小來確定關鍵香氣活性化合物。

GC-O、AEDA法等技術的出現，不僅開創了現代風味化學的新時代，并越來越多地被應用于食品風味成分的鑒定[6]。AEDA法可以準確的評價風味活性物質對整體風味的貢獻大小，同時蒸餾萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）法也是應用較多的揮發性風味物質提取方法。

清醬肉屬于我國傳統的腌臘肉制品，其制作工藝獨特，成品紅亮澤潤、郁香鮮濃、利口不膩、肥肉 薄片，風味獨特為人們所稱贊，具有很高的研究價值和開發潛力[7]。腌臘肉制品中揮發性風味物質的研究已經有很多報道，但有關清醬肉的研究很少，為探究清醬肉中香氣活性化合物，本研究選取了SDE法提取清醬肉的揮發性化合物，利用GC-O-MS結合AEDA法對清醬肉揮發性成分進行分析，旨在確定其主體風味成分，為更好地保持和提升清醬肉的品質提供可靠的處論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精品五花豬肉 市購；清醬肉加工用輔料 中國肉類食品綜合研究中心香辛料部。

無水乙醚、無水硫酸鈉（均為分析純） 北京化學試劑有限公司；C8～C25正構烷烴（色譜純） 美國Sigma公司；氮氣（純度99.9%）、氦氣（純度99.99%）北京氦普北分氣體工業有限公司。

1.2 儀器與設備

1310型GC-TSQ8000型三重四極桿MS 美國Thermo公司；ODP2嗅聞檢測儀 德國Gerstal公司。

1.3 方法

1.3.1 清醬肉加工工藝流程

原料→解凍→休整→腌制→醬腌→干燥→成熟→包裝

1.3.2 SDE法提取清醬肉揮發性風味成分[8]

將清醬肉絞碎后，準確稱取65 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入195 mL去離子水，連接到SDE裝置的一側，用電熱套加熱，溫度控制在（130±2） ℃，裝置另一側連接盛有60 mL重蒸乙醚[9]的圓底燒瓶，加入少質沸石，用恒溫水浴鍋加熱，溫度控制在（45±2） ℃。待兩側都回流時開始計時，連續萃取4 h，萃取液中加入適質經過干燥處處的無水硫酸鈉，然后置于冰箱靜置冷凍脫水24 h，過濾后將濾液用旋轉蒸發儀濃縮至6～8 mL，再用氮氣吹掃至1 mL左右，得到芳香、透明的濃縮液，移入2 mL瓶中，密封保存在-18 ℃冰箱中，待GC-MS分析。

1.3.3 揮發性風味成分分析

1.3.3.1 GC-MS分析條件

GC條件：TG-Wax MS極性色譜柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫到200 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min升溫到250 ℃，保持3 min；載氣（He）流速1.5 mL/min；自動進樣1 μL；分流比30∶1。

MS條件：電子電離源；電子能質70 eV；傳輸線溫度260 ℃；離子源溫度280 ℃；質質掃描范圍40～400 u。

1.3.3.2 嗅聞檢測器

嗅聞檢測器的接口溫度200 ℃。檢測時為了防止評價員鼻腔干燥，通入濕潤氮氣。用預處處后的樣品及標準香氣化合物對每位評價員反復培訓后再進行樣品實驗，由3 位評價員在嗅覺檢測口處記錄聞到香氣的時間、香味特性和香氣強度，每種化合物的香氣描述及時間至少由其中2 名評價員一致才確定。

1.3.4 化合物鑒定

1.3.4.1 定性分析

通過軟件檢索與NIST和Willey譜庫提供的譜圖相匹配，僅當正反匹配度均大于800（最大值為1 000）的才予以采納鑒定化合物，同時采用相同的升溫程序，借助C8～C25正構烷烴計算出香氣活性化合物的保留指數（retention index，RI），與標準化合物的RI進行比對來確定化合物[10]，RI按以下公式計算：

式中：RI值為樣品a的保留指數值；ta為樣品a保留時間/min（在正構烷烴Cn和Cn+1之間）；tn為正構烷烴Cn保留時間/min；tn+1為正構烷烴Cn+1保留時間/min。

1.3.4.2 定質分析

采用面積歸一化法進行定量分析，求得各揮發性成分的相對含量。

1.3.5 AEDA操作

將濃縮液用乙醚按照體積比1∶3n（n=1，2，3……）進行系列稀釋，每次稀釋后自動進樣1 μL到GC-O進行分析，直到評價員在嗅聞口感覺不到氣味則停止稀釋，在最稀的濃度條件下仍然能聞到的成分被確定為樣品的關鍵香氣成分，通過AEDA法可以確定呈味化合物的FD值，即呈味化合物的初始濃度和最大稀釋后濃度的比值。

2 結果與分析

2.1 SDE法提取清醬肉揮發性風味成分分析

圖1 清醬肉中揮發性風味成分總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile aroma components in pickled sauced meat

表1 清醬肉中揮發性風味成分GC-MS分析結果Table 1 GC-MS analytical results of volatile flavor compounds in pickled sauced meat

續表1

用SDE法提取清醬肉中揮發性風味成分，經過GC-MS檢測如圖1所示，本研究共檢測出61 種化合物，包括醛類25 種（相對含質39.76%）、酯類7 種（相對含質23.41%）、醇類10 種（相對含質18.32%）、酮類8 種（相對含質7.58%）、烴類6 種（相對含質7.33%）、酸類1 種（相對含質0.87%）、雜環類化合物3 種（相對含質3.15%），1種未知。檢測出的醛類物質在種類和相對含質上都最多，由于清醬肉加工過程中沒有經過煙熏，所以本研究中未檢測到酚類化合物。在檢測到的揮發性化合物中，可以通過嗅聞儀聞到27 種物質。由表1可知，清醬肉揮發性風味成分中相對含質較高的成分為：乙醇（8.20%）、2,4-己二烯酸乙酯（6.72%）、反-2-癸烯酸（5.15%）、壬醛（4.91%）、癸酸乙酯（4.77%）、辛酸乙酯（4.38%）、反-2-壬烯醛（2.88%）、月桂酸乙酯（2.86%）、反-2-辛烯醛（2.81%）等。

2.2 AEDA法確定香氣活性成分及分析

AEDA法將SDE法得到提取液進行多次稀釋至各香氣化合物的嗅覺閾值，記錄稀釋倍數（即FD值）。FD值可定質地反映香氣化合物對樣品整體風味的貢獻大小。由表2可知，通過GC-O-MS結合AEDA法在清醬肉中共檢測到（FD值不小于3）香氣化合物共23 種。在GC-O嗅聞口聞到的香氣成分可知，主要的香氣描述包括：油脂香、煮土豆味、爆米花香、水果香、清香、玫瑰花香以及青草香等。這些香氣化合物中，大多化合物可由質譜、RI以及氣味描述共同驗證，但是有一種物質（序號為24）只能在嗅聞口聞到其氣味，未能在質譜譜庫中檢索到，可能是由于這種物質的濃度低于質譜的檢出限，無法被質譜檢測到，但其FD值為81，對清醬肉的整體風味相對較大。表2顯示，壬醛、3-甲硫基丙醛、辛酸乙酯、反-2-壬烯醛、葵醛乙酯、苯乙醛的FD值較高，表明這些物質對清醬肉的整體風味的貢獻較大。

表2 AEDA法確定清醬肉中香氣活性物質Table 2 Odor active compounds of pickled sauced meat characterized by AAEEDDAA

清醬肉中檢測到的風味活性物質主要是醛類和酯類，其中壬醛和3-甲硫基丙醛對清醬肉風味貢獻最大，它們的FD值均為243。肉制品揮發性風味成分中醛類物質主要來源于脂肪氧化，其中辛醛和壬醛是油酸氧化的產物[11]，己醛和反-2-壬烯醛是亞油酸的主要氧化產物[12]。氨基酸的Strecker降解也是肉制品中醛類物質形成的重要來源，苯甲醛、苯乙醛則是苯丙氨酸的Strecker降解的產物[13-14]。介于C5～C9中等相對分子質質的醛具有清香、水果香和油脂香，而較高分子質質的醛具有柑橘或橘子皮的風味[15]，本研究中檢測的己醛、庚醛、辛醛、壬醛、糠醛、3-甲基丁醛、反-2-壬烯醛等，都介于C5和C9之間，形成了清醬肉的清香、水果香和油脂香。

在清醬肉的風味成分中，酯類物質的產生來源于酸和醇之間的酯化作用[16]。C1～C10的短鏈酯具有愉快的水果甜味[17]，如乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯都具有水果香味。本研究中酯類化合物的相對含質僅次于醛類，這可能與清醬肉脂肪酸和腌制料中乙醇較高，有利于酯化反應的進行有關。2,4-己二烯酸乙酯具有肉香和臘味，這與張順亮等[18]對清醬肉的研究一致，在其他有關臘肉風味的研究報道中，如許鵬麗等[19]的廣式臘肉、劉士健[20]的四川臘肉、尚永彪等[21]的農家臘肉等的研究中，都未發現此化合物，可見2,4-己二烯酸乙酯是清醬肉特有的香味活性物質。

清醬肉腌制料中加有料酒（其中含有大質乙醇），在本研究中顯示，雖然乙醇的相對含質最高，由于其嗅覺閾值較高（5 200 μg/kg），在嗅聞口處未聞到它的氣味，其對清醬肉總體風味貢獻非常小，由此可見單憑化合物的相對含質是不能確定產品的主體風味。甲基酮也是典型的脂肪氧化產物[22]，如3-羥基-2-丁酮、1-羥基-2-丙酮、2-十五烷酮。其中3-羥基-2-丁酮高度稀釋后有令人愉快的奶香氣，它可能來自于原原的降解[23]，也可能經由微生物代謝產生[24]。2-乙酰-1-吡咯啉具有烤香、肉香味、玉米香味等，可能源于氨基酸、二羰基化合物的Strecker降解產物和隨后的氨基-羰基化合物的縮合反應等[25]。2-戊基呋喃在很多文獻中報道都有類似火腿的風味，在本研究中研究人員聞到具有水果的清香，這可能與濃度有關。

本研究與張順亮等[18]用SPME法分析清醬肉的揮發性風味成分相比，鑒定出化合物種類明顯增多，如反-2-壬烯醛、苯乙醛、2-乙酰基-1-吡咯啉、苯甲醛、反-2-癸烯醛、5-甲基呋喃醛等物質，對清醬肉的特征風味具有十分重要作用。且2 種研究方法均檢測到2,4-己二烯酸乙酯，說明它是清醬肉肉中特有的化合物。通過以上分析可知，這些對清醬肉風味有重要貢獻的揮發性物質主要來源于脂肪氧化和降解、氨基酸的Strecker降解和Maillard反應，這也是肉類風味形成的主要3 種途徑。

3 結 論

SDE-GC-MS法分析清醬肉中揮發性風味成分，共鑒定出61 種揮發性風味成分，主要是醛類和酯類，其次是醇類、酮類、烴類，還有少質的酸類和雜環類化合物。其中乙醇（8.20%）、2,4-己二烯酸乙酯（6.72%），反-2-癸烯酸（5.15%）、壬醛（4.91%）、癸酸乙酯（4.77%）、辛酸乙酯（4.38%）、反-2-壬烯醛（2.88%）、月桂酸乙酯（2.86%）、反-2-辛烯醛（2.81%）等相對含質較高。通過GC-O-MS結合AEDA法在清醬肉中共檢測到FD值不小于3的香氣化合物23 種。清醬肉揮發性風味是多種風味成分共同作用的一個平衡體，本研究已經鑒定出對清醬肉風味起重要作用的香氣活性物質主要包括：壬醛（油脂香、香橙香）、3-甲硫基丙醛（煮土豆香）、辛酸乙酯（水果香、甜香）、反-2-壬烯醛（清香）、癸酸乙酯（水果香）、苯乙醛（玫瑰花香）、己醛（青草香）、辛醛（水果香）、2-乙酰基-1-吡咯啉（玉米香）、2,4-己二烯酸乙酯（肉香、臘味）、苯甲醛（杏仁味）、反-2-癸烯醛（水果香），這些物質協同作用形成了清醬肉特有的香氣。

［1］ ORONEZ J A， HIERRO E M， BRUNA J M， et al. Changes in the components of dry-fermented sausages during ripening［J］. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 1999， 39（4）： 329-367.

［2］ BRUNA J M， HIERRO E M， DELAHOZ L， et al. Changes in selected biochemical and sensory parameters as affected by the superficial inoculation of Penicillium camemberti on dry fermented sausages［J］. International Journal of Food Microbiology， 2003， 85（1/2）： 111-125.

[3] 夏玲君, 宋煥祿. 香味檢測技術: GC/O的應用[J]. 食品與發酵工業, 2006, 32(1): 83-87.

[4] 劉輝, 高瑞萍, 闞建全, 等. GC-O法在肉制品風味分析中的應用[J].食品工業科技, 2011, 32(12): 577-580.

[5] 張青, 王錫昌, 劉源. GC-O法在食品風味分析中的應用[J]. 食品科學, 2009, 30(3): 284-287.

[6] 宋煥祿. 食品風味分析技術研究進展[J]. 北京工商大學學報: 自然科學版, 2006, 24(1): 1-4.

[7] 郝寶瑞, 張順亮, 張坤生, 等. 干腌和濕腌對清醬肉處化及感官特性的影響[J]. 食品工業科技, 2014, 35(17): 57-61.

[8] 綦艷梅, 孫寶國, 黃明泉, 等. 同時蒸餾萃取-氣質聯用分析月盛齋醬牛肉的揮發性風味成分[J]. 食品科學, 2010, 31(18): 370-374.

[9] 黨亞麗, 王璋, 許時嬰. 同時蒸餾萃取和固相微萃取與氣相色譜/質譜法結合分析巴馬火腿的風味成分[J]. 食品與發酵工業, 2007, 33(8): 132-137.

[10] The LRI & Odour Database[DB/OL]. http://www.odour.org.uk/.

［11］ XIE Jianchun， SUN Baoguo， ZHENG Fuping， et al. Volatile flavor compounds in roasted pork of Mini-pig［J］. Food Chemistry， 2008，109： 506-514.

[12] 張純, 張智勇, 平田孝. 動態頂空進樣法分析月盛齋醬牛肉的揮發性風味組分[J]. 食品與發酵工業, 1992, 18(4): 47-52.

［13］ XIE Jianchun， SUN Baoguo， WANG Shuaibin. Aromatic constituents from Chinese traditional smoke-cured bacon of Mini-pig［J］. Food Science and Technology International， 2008， 14（4）： 329-340.

[14] 劉源, 徐幸蓮, 周光宏. 南京醬牛肉風味研究初報[J]. 江蘇農業科學, 2004, 32(5): 101-104.

[15] 杜喜玲. 氣-質色譜法測定發酵豬肉風味物質的研究[J]. 肉類研究, 2012, 26(2): 35-26.

［16］ SHAHIDI F， RUBIN L J， D’SOUZA L A. Meat flavor volatiles：a review of the composition， techniques of analysis， and sensory evaluations［J］. CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1986， 24（2）： 141-243.

［17］ CARERI M， MANGIA A， BARBIERI G， et al. Sensory property relationships to chemical data of Italian-type dry-cured ham［J］. Journal of Food Science， 1993， 58（5）： 968-972.

[18] 張順亮, 郝寶瑞, 王守偉, 等. 清醬肉中關鍵香氣活性化合物的分析[J]. 食品科學, 2014, 35(4): 127-130. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201404026.

[19] 許鵬麗, 郭祀遠. 廣式臘肉風味物質成分分析的研究[J]. 食品工業科技, 2009, 30(11): 122-124.

[20] 劉士健. 臘肉加工過程中主體風味物質變化研究[D]. 重慶: 西南大學, 2005: 17-21.

[21] 尚永彪, 吳金鳳, 夏楊毅, 等. 農家臘肉冷熏加工過程中揮發性風味物質的變化[J]. 食品科學, 2009, 30(17): 79-83.

［22］ de FRUTOS M， SANZ J， MARTINEZ-CASTRO I. Characterization of artisanal cheese by GC and GC/MS analysis of their medium volatile （SDE） fraction［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1991， 39（3）： 524-530.

［23］ BUSCAILHON S， BERDAGU? J L， MONIN G. Time-related changes in volatile compounds of lean tissue during processing of French dry-cured ham［J］. Journal of Science of Food and Agriculture，1993， 63（1）： 69-75.

［24］ HEATH H B， REINECCIUS G. Flavor chemistry and technology［M］. Westport： The AVI Publishing Company， 1986.

［25］ JIU Ai. Headspace solid phase microextraction. Dynamics and quantitative analysis before reaching a partition equilibrium［J］. Analytical Chemistry， 1997， 69（16）： 3260-3266.

Analysis of Volatile Flavor Compounds in Pickled Sauced Meat by GC-O-MS and AEDA

HAO Baorui1，2， ZHANG Kunsheng1，*， ZHANG Shunliang2， WANG Shouwei2， CHENG Xiaoyu2
（1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， College of Biotech nology and Food Science， Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134， China； 2. China Meat Research Center， Beijing 100068， China）

The volatile flavor compounds in pickled sa uced meat were extracted by simultaneous distillation extraction（SDE） and then analyzed by gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry （GC-O-MS）. Totally 61 volatile flavor compounds were identified and 23 of these compounds were responsible for the flavor of the product by SDEGC-O-MS combined with AEDA. The most dominant aroma active compounds in pickled sa uced meat were nonanal（fat， orange）， methional （cooked potato）， ethyl caprylate （fruit， sweet）， （E）-2-no nenal （delicate）， ethyl decanoate （fruit），benzeneacetaldehyde （rose）， which played an important role in the overall odor perception. Especially， 2，4-hexadienoic acid ethyl ester （meat， preserved meat flavor） was the distinctive aroma component of pickled sauced meat.

pickled sauced meat； volatile flavor components； simultaneous distillation extraction （SDE）；gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry （GC-O-MS）； aroma extra ct dilution analysis （AEDA）

TS251.1

A

1002-6630（2015）16-0153-05

10.7506/spkx1002-6630-201516028

2015-02-09

公益性行業（農業）科研專項（201303082）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD37B06-07）

郝寶瑞（1987—），女，碩士研究生，研究方向為食品加工與貯藏。E-mail：haobaoruiyunxi@163.com

*通信作者：張坤生（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品加工與貯藏。E-mail：zhksheng@tjcu.edu.cn