HPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中酸棗仁皂苷A含量及其藥動學研究

張妍，解軍波，張彥青，*

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院制藥工程系，天津300134；2.天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

HPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中酸棗仁皂苷A含量及其藥動學研究

張妍1，2，解軍波1，2，張彥青1，2，*

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院制藥工程系，天津300134；2.天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

建立高效液相色譜-質譜串聯（HPLC-MS/MS）法檢測大鼠血漿中酸棗仁皂苷A的含量，并應用于藥動學研究。大鼠靜注（4mg/kg）或灌胃（20mg/kg）給藥，不同時間取血，血漿樣品經處理后，采用HPLC-MS/MS法測定酸棗仁皂苷A含量，色譜柱為Waters YMCTM ODS-AQ S-5 120A（2.0×100mm）分析柱，以電噴霧離子化串聯質譜（ESI）及多反應監測掃描模式（MRM）進行檢測，流動相為甲醇-水（0.1%甲酸）=50∶50，流速為0.3mL/min，柱溫為30℃，根據測定結果求算藥物的藥動學參數。酸棗仁皂苷A在40 ng/mL～4 000 ng/mL的濃度范圍內線性關系良好（r2=0.999 1），各濃度水平的精密度及穩定性的RSD均小于15%，提取回收率均大于85%。大鼠注射給藥后主要藥動學參數分別為Ke0.28/h，t1/22.55 h，AUC0→t2 839.89 h·ng/mL，AUC0→∞3 201.51 h·ng/mL，灌胃給藥后主要藥動學參數分別為Ke0.51/h，t1/21.35 h，AUC0→t206.02 h·ng/mL，AUC0→∞211.13 h·ng/mL。經計算，酸棗仁皂苷A在大鼠體內的生物利用度為1.32%。本試驗所建立的檢測方法快速簡便、精密度好、靈敏度高及穩定性好，適用于酸棗仁皂苷A在大鼠體內血藥濃度測定及藥代動力學的研究。

酸棗仁皂苷A；藥動學；高效液相色譜-質譜串聯；生物利用度

酸棗仁是鼠李科植物酸棗（Ziziphus psinosa Hu）的干燥成熟種子，具有斂汗、養肝、寧心安神等多種功效[1]。酸棗仁皂苷A（（Jujuboside A，JuA）是酸棗仁的有效成分之一，具有鎮靜、催眠，降壓、降脂、抗缺氧、增強免疫功能以及對心臟的保護等廣泛的藥理效應，其應用前景十分誘人[2-4]。本研究建立了HPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中酸棗仁皂苷A的含量并對其藥動學進行了研究。研究結果顯示建立的方法快速簡便、精密度好、靈敏度高及穩定性好，適用于大鼠血漿中酸棗仁皂苷A的含量測定。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀、G1322A在線脫氣機、G1312B二元泵、G1316B柱溫箱、G1315C DAD紫外檢測器、G1367D自動進樣器、Masshunter色譜工作站：Agilent，USA；BP211D型十萬分之一電子天平：Satorius，Germany；ZH-2型渦流混合器：天津大學無線電廠；AS10200A型超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司；酸棗仁皂苷A對照品購自中國食品藥品檢定研究院；甲酸（96%）購自美國Tedia公司；色譜純甲醇與超純水均購自J.T.Baker公司。

Wistar雄性大鼠體重（200±20）g（天津藥物研究所），給藥前禁食24h，不禁水，大鼠血漿由實驗室制備。

2 方法與結果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱為：Waters YMCTMODS-AQS-5 120A（2.0× 100mm），柱溫為30℃，流動相為（0.1%甲酸溶液）-甲醇（50∶50）；流速0.3mL/min，進樣量為20μL。

2.1.2 質譜條件

離子源：電噴霧ESI（-）源，檢測方式：多反應檢測（MRM），電噴霧電壓：4 000 V，霧化氣體：N2，霧化氣壓力：35Pa；干燥氣體：N2，干燥氣流速：8 L/min；離子源溫度：350℃，碰撞氣體：高純氮氣，碰撞氣壓力：0.15MPa。酸棗仁皂苷A的質譜分析的條件參數如表1。

表1 酸棗仁皂苷A質譜分析的條件參數Table1 Parameter of Mass Spectra of Jujuboside A

按前述色譜和質譜條件對血漿樣品中酸棗仁皂苷A的含量進行測定，記錄色譜圖。圖1和圖2分別為酸棗仁皂苷A對照品、空白血漿樣品及樣品中酸棗仁皂苷A的MS2-Scan全掃描色譜圖及目標化合物的MRM色譜圖。由圖可知樣品中酸棗仁皂苷A峰型良好，方法具有較好的分離度和靈敏度，可以進行定量分析。

圖1 酸棗仁皂苷A的MS2-Scan全掃描色譜圖Fig.1 Representative M S2-Scan Chromatograms of JuA

圖2 酸棗仁皂苷A樣品的MRM色譜圖Fig.2 Representative MRM Chromatograms of JuA

2.2 對照品貯備液的配制

精密稱量酸棗仁皂苷A對照品10mg，置10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后即得濃度分別為1mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取酸棗仁皂苷A對照品溶液100μL置1.5mL離心管中，揮干后加入100μL大鼠空白血漿，渦旋混勻，再加入甲醇溶液200μL，渦旋10 min，6000 r/min離心10min，取200μL上清置干凈的1.5mL離心管中，補加100μL水，渦旋5min混勻，過濾后即得供試品溶液。

2.4 標準曲線的制備

取適量1mg/mL酸棗仁皂苷A對照品溶液用甲醇稀釋，配制成40、80、200、400、800、1000、2000和4 000 ng/mL系列濃度的供試品溶液，按照2.3項所示方法進行處理，按前述色譜和質譜條件測定。以樣品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得標準曲線方程。酸棗仁皂苷A在40 ng/mL～4 000 ng/mL的濃度范圍內線性關系良好，標準曲線方程為Y= 4.75X+36.35，r2=0.999 1。

2.5 精密度試驗

按照2.3項制備方法，制備40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的供試品溶液，精密吸取供試品溶液20μL進樣，連續進樣5次，計算得酸棗仁皂苷A峰面積的RSD分別為4.43%、2.12%和1.92%，表明精密度良好。

2.6 穩定性試驗

按照2.3項制備方法，制備40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的供試品溶液，于-20℃條件下保存，測定樣品時，在室溫條件下放置融化樣品。分別于0、3、6、12、24、48 h進行分析，測定色譜峰面積，計算得各濃度水平的酸棗仁皂苷A峰面積的RSD分別為9.17%、6.82%和4.76%，表明穩定性良好。

2.7 重現性試驗

按照2.3項制備方法，制備40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的供試品溶液各5份供試液，依法測定，計算得各濃度水平的酸棗仁皂苷A峰面積的RSD分別為7.26%、4.43%和3.97%，表明重現性良好。

2.8 提取回收率試驗

按照2.3項制備方法，制備40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的供試品溶液測定酸棗仁皂苷A的含量。再分別取40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的酸棗仁皂苷A對照品溶液100μL于1.5mL離心管中揮干，分別加入按照2.3法處理的未加藥的空白血漿200μL，補加100μL水后，搖勻，過濾后進樣測定酸棗仁皂苷A的含量。按照公式（1）計算得大鼠血漿中酸棗仁皂苷A提取回收率分別為85.64%、91.64%和86.69%，表明該方法提取回收率良好。

3 藥動學研究

取Wistar大鼠10只，隨機平均分為尾靜脈注射給藥組和口服灌胃給藥組，用乙醚使之輕度麻醉，將新鮮配制的酸棗仁皂苷A標準品生理鹽水注射劑對大鼠分別進行尾靜脈注射（劑量為4mg/kg）和口服灌胃給藥（劑量為20mg/kg），給藥后立即使之清醒。尾靜脈給藥組給藥后于10、30min、1、1.5、2、3、4、6 h和8 h經大鼠眼底靜脈叢采血約400μL～500μL，注入含有0.1%肝素鈉的抗凝管中輕搖混勻，6 000 r/min離心10min后取上層血漿?？诜辔附o藥組給藥后于10、30min、1、1.5、2、3、4、6、8 h和10 h經大鼠眼底靜脈叢采血后同上處理方法分離血漿。按照2.3法處理血漿樣品，測定血漿中的藥物濃度，計算相應藥動學參數和平均血藥濃度-時間曲線，如表2和圖3所示。

表2 大鼠給藥后酸棗仁皂苷A藥動學參數Table2 The pharmacokinetic parameters of JuA in rats following intravenous administration and oral administration of JuA

圖3 兩種不同給藥途徑的平均血藥濃度-時間曲線Fig.3 Mean（±SD）plasma concentration-time profiles of JuA

4 討論

本試驗建立了準確靈敏且快速的高效液相色譜-質譜聯用技術（HPLC-MS/MS）來測定大鼠血漿樣品中酸棗仁皂苷A的濃度。結果顯示，大鼠血漿樣品中的酸棗仁皂苷A在40 ng/mL～4 000 ng/mL的濃度范圍內線性關系良好，各濃度水平的精密度及穩定性的標準偏差均小于15%，提取回收率均大于85%，由此說明藥物經本方法處理后性質穩定，符合血漿樣品分析的各項要求，適用于大鼠血漿中酸棗仁皂苷A的含量測定。

本研究以Wistar大鼠為實驗動物，以尾靜脈注射給藥方式作為對照，研究酸棗仁皂苷A灌胃給藥后，藥物在大鼠體內的藥代動力學過程。結果表明，酸棗仁皂苷A在大鼠體內呈現線性動力學特征，但該藥物經灌胃給藥后的生物利用度很低，初步推測藥物可能是以原型的形式或發生某種轉化后大量存在與胃腸道中，或是通過其他途徑發揮藥效作用，具體結論仍需進一步實驗對其進行佐證。

[1] 中華人民共和國藥典[M].北京:化學工業出版社,2010

[2]Shea J L,Mochizuki T,Sagvaag V,et al.Rapid eye movement(REM) sleep homeostatic regulatory processes in the rat:changes in the sleep-wake stages and electroencephalographic power spectra[J]. Brain Research,2008,1213:48-56

[3] Wang X H,Li Z,Wang X.Sedative and hypnotic effects of suanzaoren decoction in different dose[J].Journal of Shanxi College Traditional Chinese Medicine,2006,7:19-20

[4] Cao J X,Zhang Q Y,Cui SY,et al.Hypnotic effect of jujubosides from Semen Ziziphi Spinosae[J].Journal of Ethnopharmacology, 2010,130:163-166

Determination of Jujuboside A in Rat Plasm a by HPLC-MS/M S and Its Pharmacokinetics Study

ZHANG Yan1，2，XIE Jun-bo1，2，ZHANG Yan-qing1，2，*
（1.Tianjin University of Commerce，School of Biotechnology and Food Science，Department of Pharmaceutical Engineering，Tianjin 300134，China；2.Tianjin Key Laboratary of Food Biotechnology，Tianjin 300134，China）

To establish a method for the determination of the concentration of Jujuboside A（JuA）in rat plasma by liquid chromatography-mass/mass spectrometry（HPLC-MS/MS），and study its pharmacokinetics.The rats were intravenously （4 mg/kg）or oral（20 mg/kg）administrated JuA.Blood samples were drawn from the palpebra at different stages.The concentrations of JuA in the plasma were determined by the HPLC-MS/MS method.Chromatographic separation was carried out with a security guard Waters YMCTM ODS-AQS-5 120A（2.0×100 mm）（Waters，USA）.HPLC-MS/MS was performed on a triple-quadrupole mass spectrometry equipped with electrospray ionization（ESI）and negative multiple reaction monitoring （MRM）.The mobile phase consisted of methanol-water-formic acid （50∶50∶0.1），delivered at the flow rate of0.3mL/min under 30℃.The method was linear over the concentration range of 40 ng/mL-4 000 ng/mL（r2=0.999 1）.The relative standard deviations of the assay were less than 15.0%for the low，and the recovery of the method was more than 85%.The pharmacokinetic parameters were as follows：Ke0.28/h，t1/22.55 h，AUC0→t2 839.89 h·ng/m L，AUC0→∞3 201.51h·ng/mL in rat with intravenous administration，and Ke0.51/h，t1/21.35h，AUC0→t206.02h·ng/mL，AUC0→∞211.13 h·ng/mL in rat with oral administration.The bioavailability of JuA was1.32%.The developed method was successfully applied to the estimation of the pharmacokinetic parameters of JuA.

Jujuboside A；pharmacokinetic;HPLC-MS/MS；bioavailability

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.028

2013-11-22

張妍（1987—），女（漢），碩士研究生，從事生物活性物質的分離篩選的研究工作。

*通信作者：張彥青（1974—），女（漢），副教授。