殼寡糖對杏果實抗病性及活性氧代謝的影響

阿衣木古麗·艾賽提，王英，賈盼盼，朱璇

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052）

殼寡糖對杏果實抗病性及活性氧代謝的影響

阿衣木古麗·艾賽提，王英，賈盼盼，朱璇*

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052）

為研究殼寡糖處理對杏果實貯藏期間抗病作用中活性氧變化的影響。以新疆塞買提杏為試驗材料，選用分子量5000u、濃度為0.50%的殼寡糖對杏果實進行減壓滲透處理。處理后的杏果實貯藏在溫度為4℃、RH 90%～95%的冷庫中，定期測定杏果實接種發病率、病斑直徑、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）的活性和超氧陰離子（Superoxideanion，·）產生速率及過氧化氫（Peroxide，H2O2）的含量。結果表明，殼寡糖處理的杏果實發病率顯著低于對照果實，且可誘導杏果實早期·和H2O2的含量的積累，并使·產生速率和H2O2含量在杏果實貯藏后期保持在較低水平，增強了杏果實中SOD、CAT、POD和APX的活性。說明殼寡糖處理可降低果實發病率，誘導活性氧的迸發和相關抗氧化酶酶活性的顯著增強，提高了果實的抗病性。

杏；殼寡糖；活性氧；抗病性

杏（Prunusarmeniacal）屬薔薇科，李屬，屬于呼吸躍變型果實[1]。杏是新疆主要栽培果樹之一，據2011年新疆統計年鑒所示，新疆杏樹種植面積為21.2萬hm2，占全疆果樹種植面積的21.37%，杏果實產量為132.3萬t，是疆內水果總量的22.28%[2]。新疆獨特的地理環境是新疆的鮮杏風味獨特，營養豐富，既可以制干也可以鮮食，深受廣大消費者喜愛。但是杏后熟期短，采后常溫下幾天內果實變軟、品質、風味迅速下降并造成大量果實腐爛。研究表明，杏采后腐爛損失主要是由病原微生物侵染引起的，引起杏采后腐爛的病原菌主要有鏈格孢（Alternaria alternata）、青霉（Penicillium expansum）、根霉（Rhizopusstolonifer）。目前主要通過化學殺菌劑控制杏的采后腐爛，但隨著人們對食品安全和質量要求的增加，化學殺菌劑的長期和廣泛使用所帶來的農殘超標、抗性菌株的產生以及環境污染等問題日益引起人們的關注，因此化學殺菌劑的使用越來越受到限制。因此，尋求新的、安全的、對環境友好的、并對杏果實貯藏品質有良好效果的新型保鮮方法是生產上亟待解決的問題。

研究表明，果蔬經物理的、化學的以及生物的方法預先處理后，可提高果蔬自身的免疫機制減少病原菌的侵染，從而延長果蔬的貯運期和貨架期，具有安全、無污染和簡單易行的特點，具有很大的應用潛力。目前誘導抗病性作為防治果蔬采后病害的一個重要方面已受到國內外的廣泛關注，為果蔬產品病害的防治開辟了一條新途徑[3]。殼寡糖（oligochitosan）是指由殼聚糖經酸水解或酶水解而制得的2個～10個氨基葡萄糖組成的低聚糖而獲得的低聚合度水溶性的糖類。殼寡糖比普通的殼聚糖具有更強的抑菌能力，且水溶性好、可生物降解，對人畜無毒，并且能誘導植物產生抗病性，是誘導果蔬抗病性的重要因子[4]。近年來，殼寡糖在園藝產品中的應用受到重視，作為一種外源性生物激發子，應用于柑橘、杏、棗、青椒等園藝產品采后病害的控制[5-8]。

研究發現，活性氧與果蔬抗病反應密切相關。在果蔬的抗病反應中，活性氧爆發被認為是引起果蔬早期抗病反應的重要因子，一方面產生的H2O2和超氧陰離子（O2-·）直接攻擊病原菌，抑制病原微生物發育；另一方面爆發的活性氧分子如H2O2可作為第二信使參與植物系統抗病性的誘導[9]。低濃度的活性氧積累對果蔬是有益和必需的，而高濃度活性氧對果蔬是有害的。在果蔬的抗病反應中，誘抗劑還會激發果蔬體內形成一系列清除活性氧的體系，使果蔬體內活性氧水平保持動態平衡。目前有關殼寡糖誘導抗病性和活性氧代謝的研究主要集中在對植物幼苗和懸浮培養細胞的誘抗反應上，如郭紅蓮和zhao等研究發現，殼寡糖處理可以誘導草莓懸浮培養細胞和煙草幼苗活性氧的迸發[10-11]。但是有關殼寡糖處理對果實誘導其抗病反應中活性氧代謝含量變化研究較少，本實驗以采后杏果實為材料，研究了殼寡糖處理后對杏果實采后黑斑病發病率的變化及杏果實體內活性氧的產生及活性氧清除相關酶活性的變化，探討其誘導杏果實抗病性的機制，為殼寡糖在杏果實病害控制上的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料和設備

賽買提杏于2012年6月25日采摘于新疆庫車縣烏恰鎮，大小和成熟度均勻，無病蟲害和機械損傷；殼寡糖分子量5 000 u，脫乙酰度90%，食品級，購自濟南海得貝海洋生物工程有限公司。

供試病原菌：鏈格孢菌（Alternaria alternata（Fr.）Keissl）株由新疆農業大學果蔬采后生理研究實驗室提供。

超凈工作臺：蘇州凈化設備廠；高壓滅菌鍋：YXQ－SG46－280S上海博訊實業有限公司；生化培養箱：江蘇南通五金電器廠；顯微鏡：XSP－2CA廈門Motic實業集團有限公司；紫外分光光度計：TU-1810北京普希通用儀器有限責任公司；循環水式多用真空泵：SHBIII鄭州長城科工貿有限公司；電子分析天平：AL204-IC梅特勒-托利多儀器廠上海有限公司；電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器廠；高速冷凍離心機：GL-20G-II上海安亭科學儀器廠。

1.2 殼寡糖損傷接種發病率和病斑直徑測定

參考Molloy的方法進行[12]。杏采收后，用分子量為5 000，濃度0.50%殼寡糖以減壓方式處理杏果實（將杏果實浸入到真空干燥器中，抽真空至壓為0.05MPa時保持2min，然后恢復到常壓讓果實繼續浸泡10min，取出自然晾干后）進行損傷接種，以蒸餾水處理的杏果實作為對照。接種前用70%的酒精擦拭杏果實表面進行消毒，然后用滅菌鐵釘在杏果實中部穿刺一個直徑為0.50mm深度為0.30mm的孔，然后用微量進樣器將15μL交孢鏈格孢孢子懸液（1×106cfu/mL）注射到孔中，待菌液吸收后單果包裝，置于塑料筐內，于4℃、90%～95%RH的冷庫中貯藏。每天觀察杏果實的接種發病率和利用十字交叉法測量病斑直徑。以注射孔菌斑直徑大于0.50mm時即為接種發病果實。每處理用果30個，重復3次。果實接種發病率計算公式如下：

1.3 測定方法及指標

用分子量為5 000，濃度0.50%殼寡糖以減壓方式處理杏果實（將杏果實浸入到真空干燥器中，抽真空至壓為0.05MPa時保持2min，然后恢復到常壓讓果實繼續浸泡10min，取出自然晾干），將處理后的杏果實置于溫度為4℃、RH 90%～95%的冷庫中貯藏，以蒸餾水處理的杏果實作為對照，每處理用杏果實4kg，重復3次。每隔7天從冷庫中取出杏果實進行各項相關指標的測定。

1.3.1 H2O2含量的測定

H2O2含量測定參照Zhou的方法進行測定并改進[13]。H2O2含量以μmol/g FW表示，測定時重復3次。

1.3.3 CAT活性的測定

CAT活性測定參照曹建康方法，采用比色法測定[15]。以每克鮮重（FW）果蔬樣品每分鐘吸光度變化值增加0.01時為1個過氧化物酶活性單位（U），則U= 0.01△OD240·min-1·g-1FW。

1.3.4 SOD活性的測定

SOD的測定參照曹建康的方法[15]。以每分鐘每克鮮重（FW）果蔬組織的反應體系對氮藍四唑（NBT）光化還原的抑制為50%時為一個SOD活性單位（U）表示，結果以U/g·FW表示。

1.3.5 POD活性的測定

參照曹建康方法，采用分光光度計法測定[15]。以每克鮮重（FW）果蔬樣品每分鐘吸光度變化值增加1時為1個過氧化物酶活性單位（U），則U=△OD470·min-1· g-1FW。

1.3.6 APX活性的測定

APX活性參考Nakano的方法進行并改進[16]。以每克鮮重（FW）樣品每分鐘OD290值變化0.01時為一個酶活性單位（U），則U=0.01△OD290·min-1·g-1FW。

2 數據分析

應用Spass16.0軟件對數據進行方差分析，并利用鄧肯式多重比較進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2.1 結果與分析

2.1.1 殼寡糖處理對杏果實損傷接種發病率的影響

如圖1所示，殼寡糖處理降低了杏果實接種交孢鏈格孢菌（A.alternata）的發病率。在接種后的第21天殼寡糖處理的杏果實接種發病率比對照低50.0%（P＜0.05）；在接種后第28天，對照組發病率已達到66.67%，殼寡糖處理組仍然保持著較低的發病率，發病率為33.33%，比對照組小50.07%（P＜0.05）。

2.1.2 殼寡糖處理對杏果實接種病斑直徑的影響

圖1 殼寡糖處理對杏果實損傷接種發病率的影響Fig.1 Effectsof oligochitosan on disease incidenceof apricot fruit inocu lated w ith Alternaria alternata after harvest

圖2 殼寡糖處理對杏果實接種病斑直徑的影響Fig.2 Effects ofoligochitosan on lesion diam er teofapricot fruit inoculated w ith Alternaria alternata after harvest

由圖2可知，殼寡糖處理組病斑直徑一直低于對照，在接種后的第21、28天和35天殼寡糖處理組杏果實病斑直徑分別為0.85、1.92、2.91mm，比對照小47.48%、48.50%、46.75%（P＜0.05）。在接種后的第42天，殼寡糖處理病斑直徑為3.92mm，比對照組小54.02%（P＜0.05）。試驗結果表明，殼寡糖處理能有效抑制杏果實接種病斑直徑的增加。

2.1.3 殼寡糖處理對杏果實H2O2含量的影響

在貯藏前期，殼寡糖處理組杏果實H2O2含量高于對照，后期含量下降，如圖3所示。

圖3 殼寡糖處理對杏果實過氧化氫含量的影響Fig.3 Effectsofoligochitosan on H2O2contentofapricot fruit

在杏果實貯藏的第14天，殼寡糖處理H2O2含量達到最大值4.82μmoL/g FW，高于對照2.17倍。隨后，殼寡糖處理H2O2含量開始下降，并且在后期低于對照的含量。試驗結果表明，殼寡糖能引起杏果實早期短暫的含量積累，在后期H2O2水平降低。

2.1.4 殼寡糖處理對杏果實O2-·產生速率的影響

圖4 殼寡糖處理對杏果實超氧陰離子產生速率的影響Fig.4 Effectsofoligochitosan on O2-·product rate of apricot fruit

殼寡糖處理對杏果實CAT活性的影響見圖5。

圖5 殼寡糖處理對杏果實過氧化氫酶活性的影響Fig.5 Effectsof oligochitosan on catalaseactivity ofapricot fruit

由圖5可以看出，在貯藏前期，殼寡糖處理組的CAT活性低于對照組；貯藏14天后，殼寡糖處理組的CAT活性呈現明顯的上升趨勢，此后的貯藏時間一直高于對照組。在貯藏的第2天，殼寡糖處理組CAT活性達到最高，比對照組高46.59%（P＜0.05）；在貯藏的第42天，高于對照18.62%（P＜0.05）。

2.1.6 殼寡糖處理對杏果實SOD活性的影響

殼寡糖處理對杏果實SOD活性的影響見圖6。

SOD是植物體內重要的抗氧化酶，與活性氧清除密切相關。如圖6所示，在杏果實貯藏前期，殼寡糖處理組和對照組SOD酶活性差異不明顯，在貯藏14 d后，殼寡糖處理組SOD酶活性呈現明顯的上升趨勢。在貯藏的第21天和第42天，殼寡糖處理組SOD酶活性分別比對照組高60.23%（P＜0.05）和28.74%（P＜0.05）。

圖6 殼寡糖處理對杏果實超氧化物岐化酶活性的影響Fig.6 Effectsof oligochitosan on superoxide dismutase activity of apricot fruit

2.1.7 殼寡糖處理對杏果實POD活性的影響

殼寡糖處理對杏果實POD活性的影響見圖7。

圖7 殼寡糖處理對杏果實過氧化物酶活性的影響Fig.7 Effectsof oligochitosan on peroxidase activity of apricot fruit

POD是廣泛存在于植物體內的氧化還原酶，其作用主要是催化氧化還原反應中產生的H2O2。由圖7所示，在貯藏前期，殼寡糖處理組的POD活性低于對照組；貯藏14 d后，殼寡糖處理組的POD活性呈現明顯的上升趨勢，此后的貯藏時間一直高于對照組。在貯藏的第21、28天和42天，殼寡糖處理組杏果實的POD活性分別比對照高40.47%（P＜0.05）、34.78%（P＜0.05）和12.10%（P＜0.05）。

2.1.8 殼寡糖處理對杏果實APX活性的影響

殼寡糖處理對杏果實APX活性的影響見圖8。

圖8 殼寡糖處理對杏果實抗壞血酸氧化酶活性的影響Fig.8 Effectsof oligochitosan on ascorbateperoxidase activity of apricot fruit

由圖8可知，杏果實在貯藏過程中APX活性呈先上升后下降的趨勢，殼寡糖處理組杏果實APX活性在整個貯藏期均高于對照組。在貯藏的第21天和42天，殼寡糖處理組杏果實的APX酶活性分別比對照組高95.02%（P＜0.05）和65.79%（P＜0.05）。試驗結果表明，殼寡糖處理可增強杏果實APX活性。

3 討論

殼寡糖已被廣泛用于植物抗病性的誘導和病害的防治[17-18]，已有研究結果表明，在園藝產品采后處理方面，采后殼寡糖處理能誘導柑橘、杏、棗、青椒等果實對病原菌侵染的抗性反應，有效降低果實的發病率[5-8]。本研究表明，用分子量5 000 u，濃度0.5%殼寡糖處理采收后的杏果實，能有效降低杏果實的損傷接種發病率和病斑直徑。

近年來，人們對果蔬采后活性氧的代謝和相關抗氧化酶變化規律的深入研究發現，各種誘抗劑不僅可以誘導采后果蔬抗病性提高，同時還能誘導活性氧含量的增加，許多研究表明，在誘導處理的前期，果實的活性氧水平迅速升高[19-21]。H2O2的快速積累是植物-病原菌互作過程中出現的早期事件之一[22]。本實驗中，殼寡糖處理暫時地抑制了杏果實的CAT活性，有利于H2O2在果實組織內快速積累，這與Wendehenne等和Xu等的研究結果是一致[23-24]。殼寡糖處理后果實H2O2水平的升高是與殼寡糖抑制了CAT活性而顯著提高SOD活性密切相關。在果實與病原菌相互作用過程中，杏果實組織內升高的H2O2水平本身可參與抗菌物質的合成；參與POD作用下的細胞壁物質的氧化交聯反應，形成結構性屏障以阻止病原菌的進一步擴展；而且H2O2可作為第二信使誘導一些編碼病程相關蛋白的基因的表達，參與植物系統抗病性的誘導[17，25]。

活性氧的積累還可能對果實組織造成傷害，加速果實的衰老進程。但在正常情況下，果實能很快調整體內生化代謝，以減輕這種氧化脅迫。近年的研究證實，誘抗劑可以誘導果蔬活性氧的迸發和激發果蔬體內一系列清除活性氧的體系，來抵御活性氧及氧自由基對細胞膜系統的傷害，SOD、CAT、POD和APX均在在活性氧清除過程中起著重要作用，通常作為一種應激反應隨著活性氧水平變化而變化[25]。本試驗中，殼寡糖處理杏果實的SOD、CAT和POD活性在貯藏14天后均出現增加趨勢，明顯高于對照；APX可通過AsAGSH循環催化細胞內H2O2轉變成H2O，殼寡糖處理杏果實的APX活性在整個貯藏過程中均高于對照果實，與此相應的是，殼寡糖處理杏果實的H2O2含量和O2-·產生速率均在貯藏14天后出現下降趨勢，在貯藏后期低于對照果實。因此，殼寡糖處理杏果實可以誘導發生與植物抗病反應類似的活性氧變化，活性氧釋放在前期迸發，后期活性清除酶活性增加，活性氧含量的變化與SOD、CAT、APX和POD的活性變化具有密切關系。

綜上，殼寡糖所誘導的果實抗病反應與活性氧水平的變化密切相關，果實體內存在著一套維持活性氧平衡的生化機制，控制著活性氧的合成、積累和消除，在誘導處理的前期，果實的活性氧水平迅速升高，殼聚糖可能是通過調節SOD、CAT、POD、APX和GR等保護酶的活性，降低果實內O2-·、·OH和H2O2等活性氧的積累，升高的活性氧即可能是作為傳遞侵染信號的信號分子在起作用。而抗氧化酶活性的升降及抗氧化劑水平的升高表明受誘導果實既可盡其所能地抑制病原物的侵入和繁殖，又可使活性氧對其自身的危害降至最低。

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Effect of O ligochitosan Treatm ent on Induce Disease Resistance and Active Oxygen M etabolism in Apricot Fruits

Ayimuguli·aisaiti，WANGYing，JIA Pan-pan，ZHUXuan*
（Xinjiang AgriculturalUniversity，CollegeofFood Scienceand PharmaceuticalScience，Departmentof Food Science，Urumqi830052，Xinjiang，China）

The objective of the study was to exp lore the effect of oligochitosan treatment on active oxygen metabolism ofapricot fruits.The Saimaitiapricot fruit（Prunusarmeniacal）wasused asmaterialsand treated by vacuum infiltration 0.50%oligochitosan solution （molecularweight：5，000 u）.The treated apricot fruitwere stored at4℃，90%-95%RH.Superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），peroxidase（POD），ascorbic acid peroxidase （APX）the related active oxygenmetabolism，superoxygen anion （O2-·）production rate and hydrogen peroxide （H2O2）content were determined.Results indicated that the disease incidence in oligochitosan-treated fruits was significantly lower than that in control fruits.Oligochitosan treatment accelerated H2O2contentand·production rate.The activitiesof SOD，POD，APX and CATwere enhanced.The studies suggested that oligochitosan-treated can decreased the disease incidence，accelerated biosynesis of hydrogen H2O2，enhanced activities of SOD，CAT，POD and APX，improved the disease resistance of apricot fruits.

apricot；oligochitosan；reactiveoxygen species；disease resistance

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.030

2013-10-15

國家自然科學基金（31060232）

阿衣木古麗·艾賽提（1986—），女（維吾爾），碩士，研究方向：果蔬貯藏與保鮮。

*通信作者：朱璇（1971—），女（漢），博士，研究方向：果蔬貯藏與保鮮。