查爾酮類似物A59促人結腸癌細胞凋亡及其機制

孫余省，朱冠保，金勁激，陶禮鈞，朱維星，方軍

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.創傷外科；2.胃腸外科）

·論 著·

查爾酮類似物A59促人結腸癌細胞凋亡及其機制

孫余省1，朱冠保2，金勁激2，陶禮鈞1，朱維星1，方軍1

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.創傷外科；2.胃腸外科）

目的：通過對經初步篩選證明具有生物活性的查爾酮類似物A59可能涉及的信號通道進行檢測，進一步明確其抗腫瘤活性及作用機制。方法：對于以查爾酮為先導物設計合成類似物，以MTT法檢測其對于人結腸癌細胞（HCT-116）的殺傷作用，篩選出具有較好生物活性的化合物A59。通過FCM法檢測A59誘導HCT-116細胞凋亡和抑制細胞周期的情況。Western blot法檢測HCT-116細胞中A59對ATF4及CHOP表達的影響。利用siRNA技術敲除CHOP后，用免疫熒光和FCM法檢測在A59對于細胞凋亡的影響。結果：通過對自行設計合成查爾酮類似物進行篩選，發現A59對于HCT-116具有較強的增殖抑制作用（IC50=7.6 μmol/L）。通過FCM法檢測發現A59是通過誘導HCT-116細胞發生凋亡并抑制細胞周期發揮其生物活性。通過Western blot法檢測發現A59劑量依賴性激活內質網應激信號通路中的關鍵蛋白CHOP，并通過siRNA基因沉默技術進一步確證A59是通過刺激CHOP的過表達發揮促進細胞凋亡的作用。結論：查爾酮類似物A59通過激活內質網應激信號通道中的關鍵蛋白CHOP來發揮對CHT116的增殖抑制作用。

查爾酮類似物；腫瘤藥；細胞凋亡； CHOP

結腸癌是常見的惡性腫瘤，其發病率和病死率呈明顯上升趨勢[1]。雖然手術切除在癌癥治療中發揮著重要作用，但化療仍然是腫瘤治療的主要手段之一。目前部分化療藥物的不良反應大且耐受性差局限了其在部分患者中的使用，而一些傳統天然藥物中的化合物體現出了不良反應小，抗腫瘤能力強的特點[2]。

查爾酮及其衍生物是芳香醛酮發生交叉羥醛縮合的產物，廣泛存在于天然藥物中，其分子結構柔性大，能與不同的抗體結合，具有毒性低、較好的抗腫瘤、清除氧自由基、抗菌等生物活性[3-7]。但查爾酮雖然有抗癌活性，但活性并不理想。迄今為止雖有多種查爾酮類化合物運用于臨床，如利膽藥甲氧查爾酮、治療靜脈曲張的橙皮苷甲基查爾酮等，但鮮有成藥用于腫瘤的相關治療[8]。為了發現抗腫瘤效果更佳的查爾酮類似物，本研究以查爾酮為母核設計合成化合物A59，通過MTT法檢測A59抗結腸癌的活性，為A59是否能成為治療結腸癌的新型藥物提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 結腸癌細胞株（HCT-116）、HL7702人肝細胞株購自中科院細胞生物學研究所上海細胞庫，CLEAVED-PARP抗體、CHOP免疫熒光二抗、辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗兔抗體購自美國santa cruz公司，Cleaved-caspase3、GAPDH、CHOP抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Bcl-2、Bad、MDM2、CDC2、Cyclinb1、ATF4抗體購自美國SANTA公司，胎牛血清（無支原體）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI-1640培養基購自美國HyClone公司，青-鏈霉素（100×）購自吉諾生物醫藥科技有限公司，0.25%胰蛋白酶（含EDTA）購自美國HyClone公司，0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）購自美國Gibco公司，錐蟲藍購自上海生科生物有限公司，MTT試劑盒購自Roche公司。

1.2 HCT-116細胞培養 結腸癌細胞株HCT-116用含有10%無支原體胎牛血清（經56 ℃水浴鍋30 min滅活）和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養基于37 ℃，濕度飽和，含5% CO2的細胞培養箱中培養。

1.3 MTT比色實驗 將狀態良好的HCT-26細胞鋪板，每孔加入不同濃度的H175（0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L），并設置DMSO陰性對照和查爾酮陽性對照，所有標本重復3孔檢測，輕輕混勻以確保每個藥都已加入液面以下，48 h后每孔加入10 μL MTT進行反應，4 h后每孔加入200 μL裂解液，使反應產物完全溶解，16 h后置酶標儀上測定每反應孔的A值，波長為570 nm。MTT法檢測其對CT26結腸癌細胞的增殖抑制作用，計算出IC50值。

1.4 流式細胞術Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡 將處于對數期的HCT-116細胞調整至4×105/mL，進行藥物處理，每個培養皿里加入3 μL的不同濃度A59（2.5、5、10 μmol/L），并設置DMSO陰性對照和查爾酮陽性對照，所有標本重復3孔檢測，輕輕混勻。加藥12 h后收集細胞，用PBS洗2遍后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，1 mL PBS重懸細胞，計數，1 000 r/min離心5 min，棄上清用1×Binding Buffer重懸，避光后加1 μL Annexin V染色10 min后，加1 μL PI染色5 min，加400 μL×Binding Buffer進行流式細胞儀檢測。

1.5 流式細胞術PI單染法檢測細胞周期 將處于對數期的HCT-116細胞進行藥物處理，每個培養皿里加入3 μL的不同濃度（2.5、5、10 μmol/L）A59，并設置DMSO陰性對照、查爾酮陽性對照，濃度為10 μmol/L。加藥12 h后收集細胞用PBS洗2遍，棄上清，1 mL PBS重懸細胞，用100 g/mL RNase-A和100 g/mL PI各500 μL，37 ℃避光孵育30 min后進行流式細胞儀檢測。

1.6 細胞Western blot法檢測 收集對數期的HCT-116細胞，用不同濃度（2.5、5、10 μmol/L）A59、DMSO（陰性對照）及查爾酮（陽性對照）進行處理，藥物孵育24 h后收集蛋白樣品，經SDS-PAGE分析，轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，用一抗為凋亡相關蛋白抗體（1∶300 CLEAVED-PARP抗體、1∶1 000 Cleaved-caspase3抗體、1∶300 Bcl-2、Bad抗體）、細胞周期相關蛋白抗體（1∶300 MDM2、CDC2、Cyclinb1抗體）及內質網通路關鍵蛋白抗體（1∶1 000 CHOP抗體、1∶300 AFT-4、1∶1 000 GAPDH抗體）分別于4 ℃過夜，TBST洗膜后加二抗為抗兔抗體，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜后進行曝光。

1.7 HCT-116細胞CHOP基因敲除 通過siRNA靶向設計，美國Ambion公司設計CHOP核苷酸序列5′-GCAG GAAATCGAGCGCCTGAC-3′。經過PCR兩步法，人基因組DNA為模板，擴增hU6snRNA啟動子序列，外加終結子克隆到PGL3.7載體中，并用增強型綠色熒光蛋白（EGFP）做標記，經過酶切和DNA測序證明其序列的正確性。通過Fugene 6轉染法轉染到H460細胞中，48 h后，通過顯微鏡數具有熒光標記的細胞。

1.8 CHOP基因敲除的HCT-116細胞免疫熒光及細胞凋亡檢測 將處于對數期的正常HCT-116細胞（NC組）和敲除CHOP基因的HCT-116細胞（CHOP siRNA，siRNA組）調整至4×105/mL，并在正常HCT-116細胞中加入3 μL查爾酮類似物A59（終濃度為20 μmol/ L）處理12 h（NC+A59組），siRNA+A59組處理辦法同NC+A59組。于各組中加入一抗為CHOP抗體，二抗為CHOP免疫熒光抗體進行免疫熒光檢測；并使用流式細胞術Annexin V/PI雙染法對CHOP基因敲除HCT-116細胞進行凋亡檢測。

1.9 統計學處理方法 使用SPSS 17.0統計學軟件進行統計學分析。采用單因素方差分析各組間的血清抗體OD值的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 查爾酮類似物A59的合成及抑制HCT-116細胞增殖 查爾酮類似物A59結構如圖1A。MTT結果（見圖1B-C）顯示：各濃度組的A59均能顯著抑制HCT-116細胞，且隨著藥物濃度增加，對HCT-116細胞抑制效果愈顯著，呈劑量依賴性，與陽性對照（查爾酮）比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。A59對抗結腸癌的IC50為7.6 μmol/L，查爾酮的IC50為13.9 μmol/L；并且A59和查爾酮對正常肝細胞的IC50均大于20 μmol/L，說明其毒性很小。

2.2 A59對HCT-116細胞凋亡的影響 應用不同濃度（5、10 μmol/L）的A59處理HCT-116細胞，均能促進細胞的凋亡，并具有劑量依賴性，與DMSO組比較差異有統計學意義（早期凋亡P=0.0040，晚期凋亡P=0.0028），且促凋亡能力強于陽性對照（查爾酮組）（見圖2A），其中以早期凋亡為主（見圖2B），具有時間依賴性。為了檢測經不同濃度A59處理后的HCT-116細胞中凋亡相關蛋白cleaved-parp、cleavedcaspase3、Bcl-2及Bad的表達水平，分別利用相應抗體進行Western blot法分析，結果（見圖2C）提示A59可以劑量依賴性地促進活性PARP以及Caspase3、Bad的表達，同時抑制Bcl-2蛋白的表達。

圖1 查爾酮類似物A59的化學結構及對HCT-116增殖的抑制作用

圖2 不同濃度A59對HCT-116細胞凋亡的影響

2.3 A59對HCT-116細胞周期的影響 流式細胞術結果（見圖3A）顯示：HCT-116細胞經A59藥物（5、10 μmol/L）處理12 h后，HCT-116細胞增殖阻滯于G2/M期，且具有劑量依賴關系。應用周期相關蛋白抗體進行的Western blot法分析結果（見圖3B）提示，A59劑量依賴性地抑制細胞周期蛋白MDM2、CDC2及Cyclinb1。

圖3 不同濃度A59對HCT-116細胞周期的影響

2.4 A59對于內質網應激信號通道中關鍵蛋白的影響 結果（見圖4A）顯示，A59可引起內質網應激信號通道中關鍵蛋白ATF-4及CHOP表達轉錄升高，且隨著化合物劑量的上升，ATF-4及CHOP的蛋白表達量明顯升高，其中以CHOP蛋白更為顯著。用siRNA技術沉默HCT-116細胞中CHOP的表達，之后用不同濃度的A59處理12 h，通過免疫熒光技術進行驗證，發現A59可以激活正常HCT-116細胞中CHOP過表達，并在CHOP沉默后無法刺激CHOP過表達，證明成功沉默CHOP（見圖4B）。進一步通過流式細胞術Annexin V/PI雙染法檢測各組細胞凋亡情況（見圖4C），發現沉默CHOP后，A59的抗腫瘤作用減弱，說明CHOP在A59介導的細胞凋亡起到了重要的作用。

圖4 A59對于內質網應激信號通道中關鍵蛋白的影響

3 討論

于天然藥物及果蔬中廣泛存在的查爾酮及其衍生物，除了有抗感染、抗氧化、抗血管等作用外[5-7]，亦被發現具有較強的抗腫瘤能力[9]。Syam等[10]研究發現含有硼酸結構的查爾酮類似物抑制乳腺癌細胞株的增殖，Zhou等[11]發現查爾酮類似物有抗前列腺癌活性，亦有研究顯示查爾酮類似物對白血病細胞、肝癌細胞、宮頸癌細胞等具有一定的細胞毒性[12-13]，但其在結腸癌細胞中的研究非常有限。人結腸癌細胞株HCT-116是以結腸癌患者腫瘤組織為材料所建立的一種惡性結腸癌細胞株，被廣泛應用于體內外實驗，具有增殖能力強、血清依賴低等優點，故本研究選用HCT-116細胞株在體外進行了查爾酮類似物A59的抗腫瘤能力相關實驗。

本實驗首先使用不同濃度的A59作用于HCT-116細胞株，發現A59對HCT-116細胞具有明顯的生長抑制作用，致細胞生存率下降，且抑制作用強于查爾酮，具有濃度依賴性。并進一步對作用機制進行了研究，使用流式細胞術Annexin V/PI雙染法發現A59促進HCT-116細胞凋亡，且凋亡以早期凋亡為主。因為Caspase3是依賴胱天蛋白酶的凋亡途徑的重要效應者，PARP被認為是死亡底物及凋亡早期分子標志，而Bcl-2和Bad是目前已知的在凋亡調控過程中功能相互對立的一對調控蛋白[14]，因此通過Western blot法檢測凋亡相關蛋白，結果提示A59可以劑量依賴性促進活性PARP以及Caspase3、Bad的表達，同時抑制Bcl-2蛋白的表達，已知Bcl-2可抑制凋亡促進細胞存活，故進一步說明了A59促進腫瘤細胞的凋亡。

本實驗亦發現A59可抑制HCT-116細胞增殖，使細胞周期阻滯于G2/M期，誘導腫瘤細胞凋亡。已有研究認為腫瘤細胞相較正常細胞多缺失G1/S限制點，致G2/M顯得尤為重要，被認為是選擇性高、安全性好的藥物新靶點[15]。通過Western blot法分析提示A59劑量依賴性抑制細胞周期蛋白MDM2，CDC2及Cyclinb1，而Cyclinb1/CDC2是細胞周期G2/ M限制點的主要調控原件，故進一步明確查爾酮類似物 A59通過阻滯細胞進入G2/M期而抑制HCT-116細胞增殖。

引起凋亡發生的通路有很多，除了經典的死亡受體活化及線粒體損傷傳導通路外，研究發現內質網應激反應亦可引起細胞凋亡，被認為是新的細胞凋亡信號傳導通路，而CHOP則是內質網應激反應所致凋亡中一個非常重要的介導因素，細胞內CHOP過表達可引起周期阻滯或細胞凋亡[16]。本實驗通過CHOP基因敲除對細胞凋亡的影響，發現CHOP介導了A59引起內質網應激時的細胞凋亡過程，亦說明了CHOP在凋亡中發揮了重要作用，而A59通過對CHOP調節抑制腫瘤細胞的生長，被作為腫瘤治療的特異性靶點。

綜上所述，本實驗自行設計合成的查爾酮類化合物A59可抑制結腸癌細胞HCT-113細胞生長，阻滯細胞周期進程于G2/M期，誘導細胞凋亡，其機制可能是通過激活內質網應激信號通道中的關鍵蛋白CHOP而發揮作用。本研究初步揭示了查爾酮類化合物A59抗結腸癌細胞的作用及可能的作用機制，為其進一步開發及臨床應用提供理論基礎和實驗依據。

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（本文編輯：胡苗苗）

Effects and mechanisms of novel chalcone analogue-A59 on inducing colon cancer cells’ apoptosis

SUN Yusheng1, ZHU Guanbao2, JIN Jinji2, TAO Lijun1, ZHU Weixing1, FANG Jun1. 1.Department of Gastroenterological Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Gastrointestinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To further explore its anti-tumor activity and mechanisms through investigation of the signal path of novel chalcone analogue-A59. Methods: Synthesize the chalcone analogues and further test their cytotoxicity on colon cancer cell line (HCT-116) through MTT method, and pick out the one own better biological activity named A59. The ability of A59 on inducing HCT-116’s apoptosis and inhibiting its cell cycle were assayed using FCM method. The effect of A59 on ATF4 and CHOP expression in HCT-116 were assayed with Western blot. After knockdown CHOP by siRNA technology, the influence of A59 on cell’s apoptosis through immunofluorescence (IF) and FCM was further investigated. Results: A59 showed inhibitory effects on the proliferation of HCT-116 (IC50=7.6 μm). This novel chalcone analogue exerted its biological activity to induce HCT-116’s apoptosis and inhibit its cell cycle through FCM testing, and the Western blot assay indicated that A59 showed a dose-dependent activation of key protein CHOP of endocytoplasmic reticulum stress (ERS) signal path. and the siRNA technology further confirmed A59 induce apoptosis by stimulating the CHOP overexpression. Conclusion: Novel chalcone analogue-A59 shows inhibitory effects on the proliferation of HCT-116 by activating the ERS signal path’s key protein CHOP. Clarifies its mechanisms and shows the significance on the new anti-colon cancer drug research and development.

chalcone analogue; anti-cancer drug; cell apoptosis; CHOP

R730.5

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.06.007

2015-01-09

孫余?。?970-），男，浙江溫州人，副主任醫師，碩士。

朱冠保，教授，碩士生導師，Email：zgbwmc@yahoo. com.cn。