HCMV-UL138 CTL表位肽重組酵母菌的構建及其免疫效應

張躍進，柳獻云，陳向敏，田曉娟，李文姝，薛向陽

（1.溫州醫科大學 護理學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 中藥房，浙江 溫州325015；3.溫州醫科大學 生物學實驗教學中心，浙江 溫州 325035；4.溫州醫科大學 分子病毒與疫苗研究所、微生物與免疫學教研室，浙江 溫州 325035）

·論 著·

HCMV-UL138 CTL表位肽重組酵母菌的構建及其免疫效應

張躍進1，柳獻云2，陳向敏3，田曉娟4，李文姝4，薛向陽4

（1.溫州醫科大學 護理學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 中藥房，浙江 溫州325015；3.溫州醫科大學 生物學實驗教學中心，浙江 溫州 325035；4.溫州醫科大學 分子病毒與疫苗研究所、微生物與免疫學教研室，浙江 溫州 325035）

目的：以乙肝病毒表面抗原為載體，制備含人巨細胞病毒（HCMV）-UL138 CTL表位肽的重組酵母菌并分析其免疫效應。方法：根據蛋白質數據庫獲得HCMV-UL138氨基酸序列，綜合應用SYFPEITHI、Net-CTL及HLA-Bind方法篩選富含CTL表位的UL138多肽，插入到乙肝表面抗原前S2（PreS2）1-9區末端再與HBsAg序列連接，在不改變氨基酸密碼的前提下，根據酵母偏愛密碼子優化序列，進行全序列合成，克隆入pPIC3.5K酵母載體，構建pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重組質粒。重組質粒經Bgl Ⅱ處理線性化后，電轉化至GS115菌株中，構建PreS2-HBsAg-UL13815-27重組酵母，陽性整合菌株經甲醇誘導后，通過Western blot及ELISA方法鑒定目的蛋白表達。鑒定的重組酵母菌經滅活后，全菌體皮下免疫BALB/c小鼠，通過ELISA法檢測HBsAg特異性血清IgG抗體；UL13815-27CTL表位肽（VMLVLIVAILCYL）刺激免疫小鼠的脾細胞，通過檢測IFN-γ表達分析誘導產生的CTL反應。結果：PCR、酶切和測序分析表明成功構建了pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重組質粒。重組酵母經甲醇誘導后，酵母裂解液中可檢測到HBsAg特異性抗體識別的、分子量約33 kD目的蛋白。表達PreS2-HBsAg-UL13815-27滅活全菌體免疫小鼠后，可檢測到HBsAg特異性抗體，免疫小鼠脾細胞經UL13815-27CTL表位肽刺激，IFN-γ表達水平比對照組明顯升高。結論：重組酵母全菌體成功表達了PreS2-HBsAg-UL13815-27重組蛋白，且重組酵母菌全菌體免疫小鼠可誘導產生UL13815-27特異性的細胞免疫。

人類巨細胞病毒；CTL表位；乙肝病毒表面抗原；重組酵母

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是人群普遍感染的一種皰疹病毒。它可引起新生兒宮內感染或圍生期感染，造成流產、死胎、胎兒畸形、發育遲緩、聽力障礙、神經系統發育遲緩等，是人類先天性病毒感染的最常見病原體[1]。另外，HCMV的后天感染或潛伏病毒再激活還可嚴重威脅組織器官移植個體和艾滋病患者的生命[2-3]。盡管一些有效抑制病毒復制的藥物（如更昔洛偉等）已廣泛用于HCMV的預防和治療，但因不良反應（如骨髓抑制、腎毒性等）大、出現耐藥性及存在孕婦這一特殊人群，故尋求有效的疫苗仍是防治HCMV感染的主要途徑。目前在研的HCMV疫苗，雖有一定的免疫效果，但仍然存在免疫原性弱和不能清除細胞內潛伏HCMV感染等問題[4-5]。

細胞免疫，尤其是CTL反應是宿主抗胞內病原免疫的主要途徑。另外，采用基因工程方法在酵母細胞等真核表達系統中表達的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）已被證實為較好的抗原攜帶和釋放系統[6-11]。本研究擬選擇不同HCMV株間高度保守的潛伏相關膜抗原（UL138），利用生物信息學篩選富含CTL表位的肽段，同時對HBsAg進行設計，通過基因克隆技術構建表達UL138多表位-HBsAg的重組酵母，并分析其刺激小鼠產生的免疫效應。

1 材料和方法

1.1 材料 ①菌株及載體：酵母表達載體pPIC3.5K、E.coli.DH5α菌株、GS115畢赤酵母菌株均由本實驗室保存，pMD18-T載體購自TaKaRa公司。②工具酶及其他試劑：限制性內切酶BamH I、EcoR I、Bgl Ⅱ、T4 DNA連接酶、核酸分子質量標準DNA Marker、蛋白預染Marker、2×PCR Master Mix均購自Ferments公司；DEPC處理水購自TaKaRa公司；無內毒素質粒抽提純化試劑盒購自Omega公司；RPMI-1640培養液及胎牛血清購自life technologies公司；小量質粒DNA提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自上海捷瑞生物技術有限公司；HBsAg診斷試劑盒及乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）檢測試劑盒購自溫州金葉試劑公司，并按說明書步驟檢測HBsAg特異性IgG抗體；其他試劑為國產或進口分析純試劑。UL13815-27CTL表位肽（VMLVLIVAILCYL）由上海生物工程有限公司合成。Rever Tra Ace反轉錄酶試劑盒、SYBR Mastermix定量PCR試劑購自日本Toyobo公司。③實驗動物：雌性BALB/c小鼠6～8周齡均購自溫州醫科大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 HCMV-UL138富含CTL抗原表位多肽的篩選：自NCBI網站的蛋白質數據庫獲得HCMV UL138基因全序列，應用SYFPEITHI服務器（http∶//www.syfpeithi.com/）上的EPITOPE PREDICTION方法、Net-CTL服務器（http∶//www.cbs.dtu.dk/services/ NetCTL/）及HLA-Bind預測受HLA-A2限制的CTL表位。綜合SYFPEITHI、Net-CTL及HLA-Bind方法篩選富含CTL表位的UL138多肽，見表1和圖1。

1.2.2 重組質粒pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27的設計及構建：考慮到UL138 CTL表位肽插入會影響HBsAg病毒樣顆粒（VLP）的形成，本研究根據吳光華等[12]報道的中國地區C型HBV基因組參照序列（CHN-HBV07-C），選擇編碼PreS21-9（MQWNSTTLN）及HBsAg的基因序列，將編碼篩選的富含CTL表位的HMV-UL3815-27（VMLVLIVAILCYL）的基因插入到PreS21-9羧基端再與HBsAg基因序列連接，根據酵母偏愛密碼子優化基因序列。合成目的基因經BamH I和EcoR I雙酶切處理后與pPIC3.5K載體連接獲得pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重組質粒，見圖2A。以通用引物5’AOX和3’AOX行PCR鑒定，挑取陽性克隆送測序，結果正確的克隆進行后續實驗。

1.2.3 PreS2-HBsAg-UL13815-27重組酵母菌的制備及目的蛋白的誘導表達：將成功構建的重組質粒，Bgl Ⅱ酶切線性化后，電轉化GS115感受態細胞。采用組氨酸缺陷的MD平板篩選陽性克隆，并進一步行PCR鑒定，篩選PreS2-HBsAg-UL13815-27重組畢赤酵母菌。按照《畢赤酵母手冊》步驟操作，將保存于-80 ℃的菌株活化兩次后接種于BMGY培養基中，置全溫震蕩培養箱震蕩培養至OD600=5～6，離心后收集菌體。將菌體細胞重懸于BMMY培養基中，振蕩誘導表達。每隔24 h補加誘導體積1%的甲醇，誘導結束后，收集的酵母沉淀，PBS緩沖液洗滌后，用低溫超高壓連續流破碎細胞，破碎機在1 500～1 800 bar，4～6 ℃條件下進行破碎，重復處理3次，高速離心獲得蛋白。

1.2.4 Western blot和ELISA法鑒定目的蛋白表達：將酵母細胞上清液經SDS-PAGE電泳后，轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，以1∶3 000的小鼠抗HBsAg單克隆抗體（購自abcam公司）為一抗，HRP標記的羊抗小鼠（1∶6 000）為二抗（購自聯科生物技術有限公司），利用增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒（天根生化公司）顯色，檢測目的蛋白表達情況。目的蛋白均在HBsAg基礎上構建，為此采用HBsAg診斷試劑盒說明書步驟檢測酵母細胞上清液中HBsAg，進一步驗證目的蛋白表達。

1.2.5 小鼠免疫方法：雌性BALB/c近交系小鼠6～8周齡32只，隨機分為4組，分別為表達PreS2-HBsAg-UL13815-27目的蛋白的重組畢赤酵母菌組（I組）、轉化pPIC3.5K空載體的GS115酵母菌組（Ⅱ組）、GS115酵母菌組（Ⅲ組）以及UL13815-27表位肽聯合免疫轉化pPIC3.5K的GS115酵母菌組（IV組），每組8只。表達目的蛋白的重組畢赤酵母菌、轉化pPIC3.5K空載體的GS115酵母菌及GS115空菌對照，60 ℃滅活1 h，背部皮下多點注射免疫小鼠，每2周免疫1次，共3次，每次每只小鼠免疫5YU酵母（1YU相當于1×107個酵母細胞），其中IV組小鼠的免疫是將5 μ g化學合成的UL13815-27表位肽與轉化pPIC3.5K空載體的GS115酵母菌混合后進行皮下免疫。每次免疫前斷尾取血，收集血清保存于-20 ℃。

1.2.6 熒光定量RT-PCR檢測UL13815-27表位肽細胞免疫反應：流式細胞術、ELISPOT或ELISA法檢測IFN-γ是評價CTL反應的經典方法，由于瞬時表達是細胞因子的重要特征，許多研究也采用mRNA水平衡量IFN-γ的表達[13-15]。①小鼠脾細胞懸液制備：取小鼠脾臟置于含8 mL Hank’s液的平皿，以200目篩網研磨壓出脾細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，以Hank’s液洗二次，用2 mL含10%小牛血清的完全RPMI-1640培養液重懸細胞，細胞計數后用完全RPMI-1640培養液調細胞濃度5×105/mL。②脾細胞刺激：每只小鼠脾細胞懸液取0.4 mL（約5×105/mL）置于24孔培養板中，加入含10 μ g/mL UL13815-27CTL表位肽（VMLVLIVAILCYL）RPMI-1640培養液0.4 mL，使表位肽終濃度為5 μ g/mL。以5 μ g/mL ConA為陽性對照，未做刺激的小鼠脾細胞懸液為陰性對照。加樣完后將24孔培養板置于含5% CO2培養箱中培養3 h，收集細胞，加300 μ L Trizol提取RNA。③RNA提取：按Trizol說明書進行RNA提取，以15 μ L的DEPC處理水溶解RNA，置于-80 ℃冰箱保存。④RTPCR檢測：在PCR擴增儀進行反轉錄反應，總RNA與oligo dT混合后，70 ℃ 10 min，立即置冰上，后加其他成分，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，結束后反應產物用雙蒸水稀釋5倍，并于-20 ℃保存。95 ℃2 min預變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 1 min退火延伸，40個循環，所有樣品做3復孔。記錄各樣本熒光動力曲線圖和熔解曲線圖，記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環數即Ct值，采用定量PCR中的相對定量法，IFN-γ相對表達量（N）=2△△Ct，其中△△Ct=[實驗組（CtIFN-γ-CtGAPOH）-對照組（CtIFN-γ-CtGAPOH）]，由此推導得出目的基因的相對量。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS17.0軟件進行數據分析。2組獨立樣本比較采用t檢驗，3組及以上獨立樣本組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCMV潛伏相關抗原UL138富含CTL表位肽的篩選 SYFPEITHI、Net-CTL及HLA-Bind預測顯示，3種方法均高評分的HLA-A*02限制的CTL表位肽為UL13815-23（VMLVLIVAI）、UL13816-24（MLVLIVAIL）、UL13819-27（LIVAILCYL）及UL138154-162（TQFTTVAMV），提示UL13815-23肽段富含HLA-A*02限制的CTL表位。除外HLA-A*02限制的CTL表位，該肽段還含多個高評分的HLA-A*03、26，HLA-A*B08及H2-Kd限制的CTL表位，見表1和圖1。

2.2 pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重組質粒的構建及鑒定 pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重組表達質粒的設計及質粒圖譜見圖2A。PCR鑒定可擴增出與預期大小相符合的大小約774 bp的片段，重組質粒經BamH I和EcoR I雙酶切同樣顯示PreS2-HBsAg-UL13815-27基因已成功插入pPIC3.5K載體中，DNA測序結果顯示插入片段序列與設計的序列完全符合，見圖2B。

圖1 UL138富含CTL表位肽段

表1 UL138抗原HLA-A*02限制CTL表位3種方法預測結果

圖2 pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重組質粒設計和酶切鑒定結果

2.3 PreS2-HBsAg-UL13815-27重組畢赤酵母表達產物鑒定 將已構建并鑒定的重組酵母進行培養，甲醇誘導其表達目的蛋白，含目的基因HBsAg-UL13815-27的畢赤酵母菌裂解產物經SDS-PAGE電泳后，用HBsAg單克隆抗體進行Western blot法分析，可檢測到分子量約為33 kD的目的條帶，見圖3。用HBsAg診斷試劑盒檢測重組酵母菌菌體裂解產物，與空菌和空載體組比較，含目的基因的重組酵母菌菌體裂解產物中能檢測到HBsAg的存在，見圖4。

2.4 PreS2-HBsAg-UL13815-27重組畢赤酵母免疫效應分析

2.4.1 HBsAg特異性抗體檢測：表達PreS2-HBsAg-UL13815-27重組畢赤酵母、轉化pPIC3.5K空載體的GS115酵母菌及GS115空菌滅活后背部皮下多點免疫BALB/c小鼠；UL13815-27表位肽和pPIC3.5K空載體的GS115酵母菌混合后皮下免疫BALB/c小鼠；ELISA試劑盒檢測4組免疫血清中HBsAg特異性IgG抗體水平。與Ⅱ組、Ⅲ組、IV組比較，表達PreS2-HBsAg-UL13815-27重組畢赤酵母加強免疫后，血清HBsAg特異性IgG抗體水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖3 PreS2-HBsAg-UL13815-27蛋白的SDS-PAGE和Western blot法分析

圖4 ELISA法檢測重組酵母產物中HBsAg表達水平

2.4.2 細胞免疫反應檢測：用合成的UL13815-27表位肽（VMLVLIVAILCYL）刺激免疫小鼠脾細胞，檢測PreS2-HBsAg-UL13815-27重組畢赤酵母免疫誘導的、針對UL138 CTL表位肽產生的細胞免疫效應，經定量PCR檢測IFN-γ表達水平。表達PreS2-HBsAg-UL13815-27目的蛋白的重組畢赤酵母免疫小鼠脾細胞IFN-γ水平明顯升高，而且比UL13815-27表位肽聯合免疫轉化pPIC3.5K的GS115酵母菌組小鼠脾細胞產生的IFN-γ水平更高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6。

3 討論

圖5 ELISA法檢測小鼠血清中HBsAg特異性抗體IgG水平

圖6 UL13815-27表位肽刺激脾細胞后IFN-γ水平

HCMV疫苗的研究開始于減毒活疫苗，已經研究的AD169和Towne毒株的減毒疫苗僅能產生有限的免疫保護作用，且病毒具有回復突變的可能和潛在的致癌性，近年來HCMV疫苗的研究主要基于候選靶抗原的基因工程疫苗[16-18]。其中糖蛋白gB（UL55基因產物）和病毒包膜磷蛋白pp65（UL83基因產物）是最為重要的候選疫苗抗原[16-18]，但動物和臨床試驗研究發現其存在免疫原性弱、免疫范圍局限等缺點[16-18]。HCMV潛伏相關膜蛋白UL138首次由Goodrum等[19-20]通過芯片分析發現。同源性分析表明，在不同HCMV臨床分離株、實驗室株間的UL138核酸及蛋白質序列保守性高于97%[21]。實驗證實，HCMV潛伏感染的正常人群存在針對UL138的CD4+和CD8+ T細胞反應[22]；除外在潛伏期相對特異表達，UL138的表達可持續到HCMV裂解期[23]。這些研究提示UL138也是重要的HCMV疫苗候選抗原，誘導針對UL138的免疫反應除殺傷潛伏狀態的HCMV感染細胞外還可抑制HCMV活化增殖。

近年來以特異性表位為基礎表位疫苗是目前疫苗研究的熱點，它既能誘導特異性的免疫應答，又避免了天然抗原中對機體產生不利影響的成分，但表位疫苗的免疫原性弱尚待解決。研究表明，采用基因工程方法在酵母細胞等真核表達系統中表達的HBsAg已被證明是極佳的抗原攜帶和釋放系統[6-11]。有文獻報道，以HBsAg VLP為載體，用外源性CTL表位取代HBsAg的CTL表位，可明顯增強外源性表位的免疫原性[24]。在完整的HBV病毒體中，前S1（PreS1）和前S2（PreS2）與HBsAg共同組成HBV的包膜。在PreS2與HBsAg間插入外源抗原肽，理論上也能維持HBsAg VLP的構象。有研究已證明在PreS2的第7與第8個氨基酸的密碼子之間插入了人單純皰疹病毒的一段編碼300個氨基酸的核酸序列，并于酵母系統中表達，電鏡觀察到25～31 nm的病毒樣顆粒，表明插入的基因序列沒有干擾HBsAg顆粒的自我組裝[25]。因此本研究在生物信息學預測基礎上，選擇富含CTL表位的UL13815-27肽段，插入到PreS21-9區末端，再與HBsAg序列連接，構建表達PreS2-HBsAg-UL13815-27重組酵母。SDS-PAGE電泳、Western blot及ELISA法均證實目的蛋白的表達。

有研究發現，人腸道病毒71型（EV71）VP1基因作為一種含N-末端組氨酸的分泌蛋白，可在畢赤酵母菌中被表達；重組VP1在BALB/c小鼠體內產生抗Vp1抗體，在體外中和試驗中能有效地中和EV71病毒。其酵母表達的VP1蛋白保留了良好的免疫原性，可誘導分泌Th1型細胞因子[26]。此外，口蹄疫病毒VP1和合成多表位口蹄疫病毒（EG）與HSP70融合，均能在畢赤酵母中表達，并作為抗原免疫小鼠，EGHSP70可誘導分泌更高水平的IFN-γ和IL-4[27]，提示重組酵母可誘導機體產生針對靶基因的特異性反應。其中酵母細胞壁中多糖作為一種良好的天然佐劑，能促進淋巴細胞IFN-γ、IL-2和IL-4等細胞因子分泌，對于細胞免疫應答及體液免疫應答均有顯著的促進作用[28-29]。其他研究還發現，酵母細胞進入機體后，可有效地被DC細胞吞噬，并促進DC細胞的成熟分化[30]。另外，考慮到采用酵母全菌體作為疫苗，減少了目的蛋白的純化步驟，因此成本更加低廉。為此，本研究滅活酵母全菌體免疫小鼠，評價其誘導的免疫反應，結果顯示表達PreS2-HBsAg-UL13815-27目的蛋白的重組畢赤酵母免疫后，可誘導產生HBsAg特異的IgG，以及針對UL138 CTL表位肽產生的細胞免疫。而且，與UL13815-27表位肽聯合滅活酵母菌免疫小鼠相比，表達含HBsAg的重組畢赤酵母菌免疫小鼠產生的IFN-γ水平更高，提示在酵母多糖佐劑效應基礎上，HBsAg載體可進一步增強外源性表位的免疫原性。

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（本文編輯：吳彬）

Construction and immune response of recombinant whole-cell yeast expressing HCMV-UL138 CTL epit-ope

ZHANG Yuejin1, LIU Xianyun2, CHEN Xiangmin3, TIAN Xiaojuan4, LI Wenshu4, XUE Xiangyang4. 1.School of Nursing, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Pharmacy of Traditional Chinese Medicine, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 3.Biological Laboratory Education Center, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 4.Institute of Molecular Virology and Immunology, Department of Microbiology and Immunology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To construct the recombinant yeast expressing HCMV-UL138 CTL epitope based on the carrier of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg), and further explore its immune response. Methods: The complete amino acid sequence of HCMV UL138 was retrieved from the SwissProt Database. The CTL epitopesriched peptide screened by the methods of SYFPEITHI, Net-CTL and HLA-Bind were inserted into the C-terminal of PreS21-9 sequence, then linked to the N-terminal of HBsAg sequence. The aim sequence optimized according to the yeast cell codon preference was synthesized and cloned into pPIC3.5K vector of yeast expression. The constructed pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27recombinant plasmid was linearized by Bgl II restriction enzyme and electricity transformed into GS115 strain to construct PreS2-HBsAg-UL13815-27recombinant yeast. Identified recombinant strains were then induced by methanol. The expression of aim protein was identified by Western Blot and ELISA methods using HBsAg antibodies. The identified recombinant yeast cells wereinactivated by heat and vaccinated mice by subcutaneous injection. Specific antibodies to HBsAg were detected by ELISA, and cytotoxic T lymphocyte (CTL) response were detected by investigating the interferon-γ (IFN-γ) expression by RT-PCR when immune spleen cells of mice were stimulated by UL13815-27CTL epitope peptide (VMLVLIVAILCYL). Results: Data of PCR detection, restriction enzyme digestion and sequencing analysis showed that pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27recombinant plasmid was successfully constructed. After induced by the methanol, HBsAg-specific antibodies confirmed the expression of PreS2-HBsAg-UL13815-27with molecular weight about 33 kD in the lysate of the recombinant yeast. The immunization of inactivated recombinant whole-cell yeast expressing PreS2-HBsAg-UL13815-27could induce significantly anti-HBsAg-specific IgG antibodies. When the immune spleen cells of mice were stimulated by UL13815-27CTL epitope peptide, analysis of cellular immune revealed that the production of IFN-γ significantly increased in the group of inactivated recombinant whole-cell yeast expressing PreS2-HBsAg-UL13815-27than that in the control groups. Conclusion: The recombinant Pichia pastoris yeast expressing PreS2-HBsAg-UL13815-27protein is successfully constructed. The specific UL138-specific cellular immune response can be induced in the immunized mice with recombinant whole yeast cells.

human cytomegalovirus (HCMV); CTL epitope; HBV surface antigen (HBsAg); recombinant yeast

Q939.91

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.06.004

2015-02-02

國家自然科學基金資助項目（81001343、81472308）；浙江省自然科學基金資助項目（Y2100909）；溫州市科技局科研基金資助項目（Y20120159）。

張躍進（1960-），女，浙江溫州人，實驗師。

薛向陽，副教授，Email：wzxxy001@163.com。