TOPO Ⅱα啟動子調控因子組蛋白甲基化修飾在苯中毒致造血毒性中的作用

施益芬，鄭周懿，陳晶晶，錢珊瑚，歷嘉琪，俞康

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 血液科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學，浙江 溫州 325035）

·論 著·

TOPO Ⅱα啟動子調控因子組蛋白甲基化修飾在苯中毒致造血毒性中的作用

施益芬1，鄭周懿2，陳晶晶2，錢珊瑚2，歷嘉琪2，俞康1

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 血液科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學，浙江 溫州 325035）

目的：研究拓撲異構酶（TOPO）Ⅱα啟動子調控因子（SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、NF-M、P53、CMYB、C-JUN、ICBP90）組蛋白甲基化修飾在苯中毒致造血毒性中的作用。方法：25例臨床慢性苯中毒患者骨髓單個核細胞為病例組，25例正常人骨髓單個核細胞為對照組，染色質免疫沉淀分析（ChIP）技術探討TOPO Ⅱα啟動子各調控因子組蛋白甲基化水平的變化，RT-PCR法測定TOPO Ⅱα啟動子各調控因子mRNA表達水平的改變。結果：①與對照組比較，病例組TOPO Ⅱα啟動子調控因子NF-M、C-JUN組蛋白H3K4甲基化水平下降，差異有統計學意義（P＜0.05），SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、P53、C-MYB、ICBP90組蛋白H3K4甲基化水平無明顯改變（P＞0.05）；SP1、NF-M組蛋白H3K9甲基化水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），而ATF-2、SP3、NF-YA、P53、C-MYB、C-JUN、ICBP90組蛋白H3K9甲基化水平無明顯改變（P＞0.05）。②與對照組比較，病例組TOPO Ⅱα啟動子調控因子SP1、NF-YA、C-MYB、NF-M及C-JUN mRNA表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），ATF-2、ICBP90 mRNA表達水平不變（P＞0.05），SP3、P53 mRNA表達水平則升高（P＜0.05或P＜0.01）。結論：①慢性苯中毒TOPO Ⅱα啟動子調控因子組蛋白化學修飾水平的改變伴隨著調控因子mRNA水平的變化。②TOPO Ⅱα啟動子調控因子組蛋白甲基化修飾在苯中毒所致的造血毒性中發揮一定的作用。

苯；拓撲異構酶Ⅱα啟動子調控因子；組蛋白甲基化；染色質免疫沉淀分析法

苯是明確的職業致癌物，工業用途廣泛。苯接觸從業人員多，苯誘發的造血系統疾病發病率高，衛生部2010年職業病防治工作和2011年重點工作情況通報中，苯中毒均位列慢性職業中毒前3位。盡管苯所致造血毒性已得到廣泛重視[1]，但其毒性機制仍未闡明。近年來，拓撲異構酶（TOPO）在苯致造血毒性中的作用日益受到關注[2-3]。本課題組前期的研究顯示，苯及其代謝物影響骨髓單個核細胞TOPO Ⅱα表達及活性，TOPO Ⅱα啟動子組蛋白乙酰化、甲基化水平改變是其含量下降的機制之一[3-5]。本研究進一步探討TOPO Ⅱα表達降低是否還伴隨著TOPO Ⅱα啟動子調控因子組蛋白化學修飾水平的改變，為進一步認識苯中毒相關疾病的發病機制提供依據。

1 對象和方法

1.1 研究對象 取本院血液科臨床慢性苯中毒患者（病例組）的骨髓標本25份，其中男9例，女16例，平均年齡32.5歲（20～56歲），苯接觸時間≥6個月（6個月～5年）。工作環境中苯濃度平均為87 mg/ m3（50～1 000 mg/m3），超過時間加權平均容許濃度（PC-TWA，6 mg/m3）及短時間接觸容許濃度（PC-STEL，10 mg/m3）。25例年齡、吸煙、飲酒習慣等匹配的健康志愿者為對照組，男11例，女14例，平均年齡33.8歲（19～58歲）。苯中毒診斷依據：GBZ 68-2002《職業性苯中毒診斷標準》。本研究已通過溫州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會的認證。所有骨髓捐獻者簽署知情同意書。

1.2 實驗材料 淋巴細胞分離液（天津TBD生物技術發展中心），染色質免疫沉淀分析（ChIP）檢測試劑盒、抗二甲基組蛋白H3K9抗體、抗三甲基組蛋白H3K4抗體（美國Upstate公司），體積分數為37%的甲醛溶液（美國Sigma公司），Trizol（Invitrogen，Carlsbad，CA），platinum R PCR Super Mix（Invitrogen，Carlsbad，CA），GeneRulerTM50 bp DNA Ladder（MBI Fermentas）。

1.3 實驗方法

1.3.1 骨髓單個核細胞懸液的制備：取病例組及對照組骨髓5 mL，肝素（50 U/mL）抗凝，淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離制備成單個核細胞懸液。錐蟲藍染色檢測活細胞率，要求拒染率達95%以上。骨髓單個核細胞懸浮培養，調整細胞終濃度為1×106個/mL。

1.3.2 ChIP：按ChIP檢測試劑盒說明書進行。經預處理的細胞用終濃度為1%的甲酰胺固定10 min，使轉錄因子與DNA交聯，用細胞裂解液破膜后，通過超聲將DNA打碎成250～1 000 bp（此處提取的DNA片段命名為input DNA）。用特異性抗體（甲基化組蛋白H3K4、H3K9抗體）沉淀DNA-蛋白復合物，用蛋白A瓊脂吸附復合物，經洗去非特異性吸附后，解交聯，沉淀的DNA片段于-20 ℃保存備用（此DNA片段命名為ChIPed DNA）。ChIPed DNA通過PCR法對目標基因（TOPO Ⅱα啟動子各調控因子）進行分析。

1.3.3 PCR擴增ChIP（甲基化組蛋白H3K4、H3K9抗體染色質免疫共沉淀）后DNA產物：①針對TOPO Ⅱα啟動子各調控因子的DNA序列設計引物（各調控因子的DNA引物序列、產物、退火溫度見表1）。②擴增條件：94 ℃ 5 min 預變性，94 ℃ 30 s，各調控因子退火溫度30 s，72 ℃ 1 min，35個循環后，72 ℃延伸10 min，4 ℃ 30 min。反應完成后用1.8%瓊脂糖凝膠電泳并照相，Quantity One圖像分析系統分析實驗結果。

表1 TOPO Ⅱα啟動子各調控因子的DNA引物

1.3.4 反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）：①RNA的提取及cDNA合成：采用Trizol法提取病例組及對照組細胞總RNA，采用隨機引物法合成cDNA。②針對TOPO Ⅱα啟動子各調控因子mRNA序列設計引物（各調控因子的mRNA引物序列、產物、退火溫度見表2）。引物與GenBank基因序列核對無誤，采用β2微球蛋白作為內參照，上游：5’-ACCCCCACTGAAAAAGATG A-3’，下游：5’-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3’，產物115 bp，進行PCR擴增。③擴增條件：95 ℃ 10 min預變性，95 ℃ 30 s，各調控因子產物退火溫度30 s，72 ℃ 30 s，35個循環后，72 ℃延伸10 min。經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，Quantity one圖像分析系統分析實驗結果。以目標基因與β2微球蛋白擴增產物的吸光度值的比值計算表達水平。

表2 TOPO Ⅱα啟動子各調控因子mRNA引物

1.4 統計學處理方法 所有實驗數據均采用SPSS 10.0統計軟件進行處理。數據以±s表示，t檢驗來確定2組間的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TOPO Ⅱα啟動子調控因子DNA水平的變化

2.1.1 與甲基化組蛋白H3K4結合的TOPO Ⅱα啟動子調控因子DNA水平變化：與對照組比較，病例組NF-M、C-JUN組蛋白H3K4甲基化水平下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、P53、C-MYB、ICBP90組蛋白H3K4甲基化水平無明顯改變（P＞0.05）。見表3、圖1。

表3 與甲基化組蛋白H3K4結合的TOPO Ⅱα啟動子各調控因子DNA水平變化（n=5，±s）

2.1.2 與甲基化組蛋白H3K9結合的TOPO Ⅱα啟動子調控因子DNA水平變化：與對照組比較，SP1、NF-M組蛋白H3K9甲基化水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；ATF-2、SP3、NF-YA、P53、CMYB、C-JUN、ICBP90組蛋白H3K9甲基化水平無明顯改變（P＞0.05）。見表4、圖2。

2.2 TOPO IIα啟動子調控因子mRNA水平的變化

SP1、NF-YA、C-MYB、NF-M及C-JUN mRNA表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；SP3、P53 mRNA表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；ATF-2、ICBP90 mRNA表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5、圖3。

3 討論

自1996年Frantz等首次提出苯的活性代謝產物抑制TOPO Ⅱ的活性開始，TOPO在苯致造血毒性中的作用日漸明確[2-3]，目前認為，苯的代謝產物可導致TOPO功能失常，繼而導致DNA損傷、誘導細胞凋亡或畸變，最終導致白血病的發生。

組蛋白的化學修飾包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、ADP2核糖化等，這些修飾改變染色質構型，導致基因轉錄調節發生變化，進而導致細胞增殖失常。近年來，組蛋白的化學修飾尤其是組蛋白的甲基化及其在轉錄調節中所起的作用逐漸成為研究的熱點。組蛋白H3K4甲基化與基因轉錄活化相關[6]，而組蛋白H3K9甲基化常見基因轉錄沉默[7]。我們的前期研究發現苯所致造血毒性與TOPO Ⅱα的表達下降相關，而TOPO Ⅱα啟動子組蛋白化學修飾改變是其表達下降的機制之一[3-5]，TOPO Ⅱα表達降低還伴隨著TOPO Ⅱα啟動子調控因子組蛋白乙酰化水平的改變（數據另文發表）。

圖1 苯中毒患者骨髓單個核細胞內與甲基化組蛋白H3K4結合的TOPO Ⅱα啟動子各調控因子DNA水平變化（ChIP）

表4 與甲基化組蛋白H3K9結合的TOPO Ⅱα啟動子各調控因子DNA水平變化（n=5，±s）

已知的TOPO Ⅱα啟動子調控因子包括SP1[8]、 ATF-2[9]、SP3[10]、NF-YA[11]、NF-M[12]、C-MYB[13]、P53[14]、ICBP90[15]、C-JUN[16]。其中，SP1、ATF-2、NF-YA、NF-M、C-MYB、ICBP90、C-JUN通過與啟動子不同的特異區域結合上調TOPO Ⅱα啟動子的活性。如SP1通過其三個“鋅指結構”與TOPO Ⅱα啟動區的GC/GT盒結合，增強TOPO ⅡmRNA的轉錄，上調TOPO Ⅱ的表達[8]，NF-YA、ICBP90轉錄因子分別與TOPO Ⅱ啟動子區的ICBs、CCAAT結合后激活TOPO Ⅱα的表達[11，15]。SP3及P53是TOPO Ⅱα啟動子的負性調控因子。SP3同樣含有3個可與GC/GT盒結合的“鋅指結構”，可與SP1競爭性結合GC/GT盒位點，但SP3的轉錄活性較低，因此競爭性抑制了由SP1介導的TOPO Ⅱ啟動子的促轉錄活性，下調TOPO Ⅱ的表達[10]。而抑癌基因P53的表達會抑制TOPO Ⅱα啟動子的活性，使TOPO Ⅱα表達受抑[14]。

圖2 苯中毒患者骨髓單個核細胞內與甲基化組蛋白H3K9結合的TOPO Ⅱα啟動子各調控因子DNA水平的變化（ChIP）

表5 TOPO Ⅱα啟動子調控因子mRNA水平變化（n=5，±s）

我們的研究發現慢性苯中毒患者TOPO Ⅱα啟動子調控因子NF-M、C-JUN組蛋白H3K4甲基化水平降低，SP1、NF-M組蛋白H3K9甲基化水平升高，結合組蛋白H3K4甲基化與基因轉錄活化相關[6]，而組蛋白H3K9甲基化常見基因轉錄沉默[7]，及各調控因子對TOPO Ⅱ表達的影響，提示TOPO Ⅱα啟動子調控因子組蛋白NF-M、C-JUN、SP1組蛋白甲基化水平的改變可能參與了TOPO Ⅱα表達的降低，DNA水平證實了苯中毒患者骨髓單個核細胞中TOPO Ⅱα啟動子的調控因子水平的改變，且伴隨著NF-M、C-JUN、SP1、NF-YA、C-MYB mRNA表達水平的降低，與TOPO Ⅱα啟動子的調控因子DNA水平的變化平行，為TOPO Ⅱα啟動子的調控因子組蛋白甲基化水平改變參與TOPO Ⅱα表達減低提供了一定的依據。本課題組將進一步研究組蛋白去甲基化酶對造血損傷的逆轉及對TOPO Ⅱα啟動子、啟動子調控因子組蛋白化學修飾的改變，為更進一步認識苯中毒相關疾病的發病機制及相關疾病的診療提供一定的依據。

圖3 苯中毒患者TOPO Ⅱα啟動子各調控因子mRNA水平的變化（RT-PCR）

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（本文編輯：丁敏嬌）

Histone methylation modification of topoisomerase IIα promoter regulation factors in patients with chronic benzene poisoning

SHI Yifen1, ZHENG Zhouyi2, CHEN Jingjing2, QIAN Shanhu2, LI Jiaqi2, YU Kang1. 1. De-partment of Hematology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To investigate histone methylation modification of topoisomerase IIα (TOPO IIα) promoter regulation factors in patients with chronic benzene poisoning, to explore the possible regulatory mechanism of TOPO IIα involved in toxicity of chronic benzene poisoning. Methods: The bone marrow samples were cellected from 25 chronic benzene poisoning cases and 25 normal controls. The Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) assay was carried out to study the possible mechanism of TOPO IIα promoter regulation factors expression changes.TOPO IIα promoter regulation factors mRNA were detected by RT-PCR technique. Results: Compared with the normal controls, the histone H3K4 methylation level of TOPO IIα promoter regulation factors NF-M, C-JUN in chronic benzene poisoning patients decreased (P＜0.05), while the histone H3K4 methylation level of SP1, ATF-2, SP3, NF-YA, P53, C-MYB, ICBP90 without obvious change (P＞0.05). The histone H3K9 methylation level of SP1, NF-M increased (P＜0.05 or P＜0.01), while the histone H3K9 methylation level of ATF-2, SP3, NF-YA, P53, C-MYB, C-JUN, ICBP90 was no significant change (P＞0.05). The mRNA expression of TOPO IIα promoter regulation factors SP1, NF-YA, C-MYB, NF-M and C-JUN were significantly lower than that in the control (P＜0.05 or P＜0.01), while the expression of SP3, P53 mRNA increased (P＜0.05 or P＜0.01), ATF-2, ICBP90 mRNA wasn’t changed (P＞0.05). Conclusion: In chronic benzene poisoning patients, TOPO IIα promoter regulation factors histone modification changes accompanied with mRNA level changed. Histone methylation modification of topoisomerase enzyme IIα promoter regulation factors play an important role in the benzene’s hematopoietic toxicities.

benzene; topoisomerase IIα promoter regulation factors; histone methylation; ChIP

R135.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.06.001

2015-02-01

國家自然科學基金資助項目（81172613）；溫州市科技局科研基金資助項目（Y20120004，Y20090238）。

施益芬（1981-），女，浙江永嘉人，主治醫師，碩士。

俞康，教授，博士生導師，Email：yukang62@126.com。