L-亮氨酸發酵培養基及基本發酵條件的優化

常珠俠

（安徽豐原發酵技術工程研究有限公司，安徽蚌埠 233010）

L-亮氨酸發酵培養基及基本發酵條件的優化

常珠俠

（安徽豐原發酵技術工程研究有限公司，安徽蚌埠 233010）

以黃色短桿菌FY-18為出發菌株，利用搖瓶發酵生產L-亮氨酸，并利用正交試驗和單因素試驗分別對其發酵培養基和基本發酵條件進行研究，從而優選出最佳培養基組分和培養條件參數。結果表明，L-亮氨酸發酵培養基的最適配比為：葡萄糖160 g/L、豆粕水解液20 g/L、玉米漿20 g/L、毛發粉15 g/L、硫酸銨70 g/ L；其發酵最佳培養條件為：初始pH 7.2，培養溫度32℃，發酵接種量為10%。在上述最佳條件下搖瓶中發酵的產酸量為22.5 g/L。

L-亮氨酸；菌種；發酵；正交試驗

氨基酸是構成蛋白質的基本單位，是生物體內不可缺少的營養成分，在生物體內具有特殊的生理功能，參與細胞中多種化合物的合成代謝。L-亮氨酸是常見的18種氨基酸之一，也是人體8種必需氨基酸之一，于1819年由Proust首先從奶酪中分離得到，后來Braconnot從肌肉與羊毛的酸水解物中得到其結晶。

L-亮氨酸在醫藥、食品、飼料、化妝品等行業具有重要用途。由于L-亮氨酸和L-異亮氨酸、L-纈氨酸的分子結構中都含有一個甲基側鏈，故被稱為支鏈氨基酸［1～2］。在醫藥行業，L-亮氨酸主要用于復合結晶氨基酸靜脈注射液，可維持危重病人的營養需求。L-亮氨酸還可用于合成具有抗癌、抗病毒、抑制細菌生長等生物活性的L-亮氨酸Schiff堿Cu2+、Ni2+、Zn2+配合物。另外，選用L-亮氨酸作為氨基酸部分的N-稀有脂肪?；?L-亮氨酸具有較高抗菌活性［1］。還有學者發現，亮氨酸的添加可抑制敗血癥引起的骨骼肌蛋白質合成減少，從而緩解其帶來的體重下降等負面效應。L-亮氨酸可用于診斷和治療小兒突發性高血糖癥和作為頭暈治療及營養滋補類藥物。L-亮氨酸與稀土的配合物是氨基酸肥料和農藥的一種，不僅能增產，防止農作物病蟲害，并且能被日光和微生物降解，是目前深受人們喜愛的“綠色農藥”。由L-亮氨酸合成的多聚物是臨時創傷敷料的最佳原料之一，也極具發展潛質［3］。

由于L-亮氨酸在多個行業均有重要應用，而目前總體狀況是供不應求，故有關其生產的研究，特別是微生物發酵法生產L-亮氨酸是未來一段時間內極為重要的研究領域。我們利用黃色短桿菌FY-18對發酵生產L-亮氨酸的工藝條件進行了初步優化研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種黃色短桿菌FY-18為安徽豐原發酵技術工程研究有限公司菌種室保藏。

1.1.2 儀器設備培英DZ-900振蕩器（太倉市實驗設備廠）；7230G可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent 1200，安捷倫科技有限公司）；生物傳感分析儀SBA-40C（山東省科學院生物研究所）等。

1.1.3 培養基種子液體搖瓶培養基（100 mL）：葡萄糖2.00 g，磷酸氫二鉀0.50 g，硫酸鎂1.00 g，硫酸亞鐵0.02 g，硫酸銨0.50 g，豆粕水解液150 mg，蛋氨酸40 mg，玉米漿0.50 g，谷氨酸4.00 g，瓊脂粉1.50 g。發酵液體搖瓶培養基（100 mL）：葡萄糖10.00 g，磷酸氫二鉀0.50 g，硫酸鎂0.50 g，硫酸亞鐵0.02 g，硫酸銨7.00 g，豆粕水解液2.00 g，蛋氨酸60 mg，玉米漿2.00 g，毛發粉1.50 g， L-異亮氨酸5 mg。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子固體平板培養方法將上述種子液體搖瓶培養基添加1.5%瓊脂粉后制得平板培養基，再用NaOH調pH至7.0，121℃30 min滅菌后，冷卻至50℃以下，待平板培養基凝固后涂布接種，并在恒溫培養箱中32℃培養24 h，待用。

1.2.2 種子液體搖瓶培養方法將上述種子培養基配制完成后，用NaOH調pH至7.2，121℃滅菌20 min，每只搖瓶中添加4 gCaCO3（預先150℃干熱滅菌準備好），從固體平板上選取一接種環的菌體接入搖瓶中，裝液量為100 mL/500 mL，培養條件31.5℃，搖床轉速200 r/min。種子合格標準為：培養時間約24 h，菌體OD值（620 nm）1.2。

1.2.3 發酵液體搖瓶培養方法將上述發酵培養基配制完成后，用NaOH調pH至7.2，121℃滅菌20 min，每只搖瓶中添加4 g CaCO3（預先150℃干熱滅菌準備好），從培養合格的種子液中吸取1 mL菌液接入搖瓶中，裝液量為100 mL/500 mL，培養條件31.5℃，搖床轉速300 r/min。

1.2.4 分析和測定方法［4］①L-亮氨酸液相測定。將發酵液做一定處理后，用高效液相色譜法定量測定發酵液中游離的L-亮氨酸含量。②發酵液菌體濃度測定。發酵液中菌體濃度采用菌體溶液吸光度A620nm表示。取發酵液0.5 mL，加入9.5 mL 0.1 mol/L稀鹽酸中和碳酸鈣，混勻，分光光度計620 nm波長下用蒸餾水做空白進行比色，比色結果記為A620nm。③發酵液殘糖的測定。采用生物傳感分析儀進行殘糖的測定。

2 結果與分析

2.1 利用正交試驗對發酵培養基關鍵組分含量的優化

對于發酵產酸而言，種子培養基的作用主要在于培養得到較多的菌體，而發酵培養基的組成及含量對于產物的合成速度及產量有著更至關重要的影響。因此有必要對發酵培養基進行研究，通過小試試驗得到的數據，并對試驗結果進行整理和分析，從而優選出最佳的發酵培養基配方。

L-亮氨酸發酵培養基配方的關鍵組分有葡萄糖（A）、豆粕水解液（B）、玉米漿（C）、毛發粉（D）、硫酸銨（E）等［5］。其中，葡萄糖是碳源，也是能源，所以需要優先考慮葡萄糖對發酵的影響；豆粕水解液、玉米漿、毛發粉等是有機氮源，其中含有微生物生長所必需的部分微量元素、氨基酸、維生素等，也是發酵培養基的重要組成成分；而硫酸銨是無機氮源，這些都是發酵培養基的關鍵因素。通過L16（45）正交試驗對菌株的發酵培養基的關鍵營養成分進行優化，其結果見表1和表2。

如表2所示，主要亮氨酸產量指標。對其分析計算，如Kx＝N1+N2+N3+N4（x為1、2、3、4，N即為A、B、C、D、E），kx=Kx/4。得到最優方案為A4B3C3D3E4，即葡萄糖160 g/L、豆粕水解液20 g/L、玉米漿20 g/L、毛發粉15 g/L、硫酸銨70 g/L。以此最優方案為發酵培養基配方的主要成分的含量為條件，得出試驗結果為22.5 g/L，即最佳產酸結果。

創新決定高度，實干鑄就輝煌。沒有創新實干的精神，就沒有遼寧曾經的勝利；沒有創新實干的精神，更不可能有遼寧明天的輝煌。習近平總書記指出， “惟創新者進，惟創新者強，惟創新者勝?！痹谶@種創新精神的指引下，在實干態度的生發下，遼寧人民在今后的發展過程中會繼續披荊斬棘，以創新的理論、創新的制度、創新的文化、創新的科技，去再創遼寧老工業基地的發展新高。

表1 L16（45）正交試驗因子水平

表2 L16（45）正交試驗數據及結果分析

2.2 利用單因素試驗對發酵培養基本條件的優化

生物發酵過程實際上是由眾多生物化學反應所構成的綜合反應過程，除了目的產物之外，還會生成許多副產物。而影響發酵過程的幾大關鍵因素，例如培養溫度、培養基初始pH和種齡等控制參數的變化對發酵產物的生成速率、產量以及副產物的形成都有著顯著的影響。因此，需要通過搖瓶的單因素對照試驗來確定上述最佳的基本條件參數［6］。

2.2.1 培養溫度的優化溫度是影響微生物生長代謝的基本環境因素之一。微生物發酵產物的的生成、菌體的生長與繁殖都與相關生物化學反應中酶的活性有著直接的關系，而酶活對溫度的變化很敏感，合適的溫度將有利于酶促反應，促進目的產物的產量。試驗利用搖瓶培養方式進行L-亮氨酸的發酵，考察26～36℃時菌株的生長和產酸情況，從而優選出最佳的培養溫度。

試驗利用搖瓶進行培養發酵，除溫度以外，其他的培養條件均相同，培養30 h后，分別對不同搖瓶的L-亮氨酸含量進行測定并進行對照分析。由圖1可知，32℃為L-亮氨酸最佳的培養溫度，30 h L-亮氨酸含量達到23.6 g/L。而26℃和36℃時，L-亮氨酸含量分別為18.3 g/L和15.8 g/L。可見，由于溫度對菌體生長及發酵相關酶系的影響，過高或過低的溫度都極大地影響L-亮氨酸的發酵水平。

圖1 不同培養溫度對L-亮氨酸含量的影響

2.2.2 發酵接種量的優化接種量是指移入種子液的體積和接種后培養液體積的比例。接種量的大小決定生產菌種在發酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發酵罐中菌株繁殖達到高峰的時間，使產物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會。但接種量過大或者過小，均會影響發酵。過大會引起溶氧不足，影響產物合成，而且會過多移入代謝廢物，也不經濟；過小會延長培養時間，降低發酵罐的生產率。

試驗利用搖瓶進行培養發酵，發酵搖瓶的接種方式為利用無菌操作吸取同一瓶成熟的種子培養液，然后按照不同的接種量添加入發酵搖瓶進行培養，其他的培養條件均相同，在培養30 h后，分別對不同搖瓶的L-亮氨酸含量進行測定并進行對照分析。如圖2所示，10%為最佳的接種量，用10%的接種量培養30 h時，L-亮氨酸的含量達到22.5 g/L；用12%的接種量時，L-亮氨酸的含量也達到22.3 g/L。而接種量為6%時，L-亮氨酸的產量最低，其次是接種量16%。分析原因為接種量過小，造成前期菌量少，生長停滯期較長，從而延長了整個發酵周期；接種量過大時，耗氧旺盛，而搖瓶中往往通氣條件受限，造成溶氧過低影響發酵。

圖2 不同接種量對L-亮氨酸含量的影響

2.2.3 初始pH的優化微生物培養環境的pH對其生長繁殖、營養代謝都有著極大的影響，而不同種類的微生物以及不同產物的生產菌所需要的最適pH都有著很大差別，因此，有必要對L-亮氨酸生產菌的最適產酸pH進行初步研究。

試驗利用搖瓶進行培養發酵，利用酸堿試劑對發酵搖瓶的初始pH進行調節，其他的培養條件均相同，在培養30 h后，分別對不同搖瓶的L-亮氨酸含量進行測定并進行對照分析。發酵所用菌種黃色短桿菌為腸道桿菌，一般最適生長pH為7.0左右。如圖3所示，在搖瓶發酵中最高產酸的初始pH為7.2，其次為pH7.6，L-亮氨酸含量分別為22.5 g/L和23.2 g/L，過高或過低的pH對其含量有著極大影響?？紤]到搖瓶發酵不能調控pH，過程pH或因為發酵產生有機酸而不斷下降，造成中后期發酵受到抑制。因此，在利用發酵罐進行L-亮氨酸發酵，且能夠用堿液維持過程pH時，控制pH為7.2可作為L-亮氨酸發酵生產最佳培養條件。

圖3 不同初始pH對L-亮氨酸含量的影響

3 小結與討論

1）利用搖瓶正交試驗對發酵培養基中關鍵組分含量進行優化，最終確定葡萄糖160 g/L、豆粕水解液20 g/L、玉米漿20 g/L、毛發粉15 g/L、硫酸銨70 g/L為發酵培養基組分最優化配方。通過搖瓶單因素對照試驗，最終確定產酸的最佳發酵基本培養條件為發酵接種量10%，培養溫度32℃，初始pH為7.2。

2）要實現L-亮氨酸發酵的工業化生產，還有許多研究工作要做。首先，菌種還需要繼續進行改良，使其能耐更高的葡萄糖濃度、縮短發酵時間、提高L-亮氨酸產量、減少雜質和雜酸的產生等。除了基本的誘變技術如紫外線誘變、化學制劑誘變等外，體內、體外的基因重組等基因工程技術也可應用于構建性狀優良的高產菌株，例如細胞融合、轉導、轉化等。其次，工業發酵的工藝參數也要進一步優化，特別是逐級放大發酵的過程中，大多數工藝參數都將有所變化，要獲得穩定的L-亮氨酸產量就要不斷摸索各種條件。L-亮氨酸的提取也是生產L-亮氨酸很重要的一步工藝，也可以從提取過程工藝條件的優化方面考慮生產的改良。

［1］中國醫藥集團上海化學試劑公司.試劑手冊［M］.上海：上?？茖W技術出版社，2002.

［2］伍時華，方杰，陳寧.L-亮氨酸高產菌的代謝控制育種［J］.生物科技通訊，2001，12（3）：27-30.

［3］張克旭.代謝控制發酵［M］.北京：中國輕工業出版社，2007.

［4］沈同，王鏡巖.生物化學［M］.北京：高等教育出版社，1990.

［5］FREUNDLICH M，BURNS RO，UMBARGER HE.Control of isoleucine，valine，and leucine biosynthesis.I. Multivalent repression［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1962，48：1 804-1 808.

［6］UMBARGER HE，BROWN B.Threonine deamination in Escherichia coli.Ⅱ.Evidence for two L-threonine deaminases［J］.J.Bacteriol，1957，73：105-112.

（本文責編：鄭丹丹）

Optimization of Medium Components and Cultural Conditions of L-leucine

CHANG Zhu-xia
（Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co.，Ltd.，Bengbu Anhui 233010，China）

Brevibacterium flavum FY-18 was used as original strain to produce L-leucine by shaking flask fermentation.The orthogonal experiments and single factor experiments were adopted to optimize the fermentation culture medium and conditions of L-leucine.The results indicated that the optimized compositions of medium were 160 g/L glucose，20 g/L soybean meal hydrolysate，20 g/L corn steep liquor，15 g/L hair powder and 70 g/L ammonium sulfate，and the fermentation conditions were initial pH at 7.2，32℃and inoculum 10%.Under the optimized fermentation conditions the production of L-leucine was up to 22.5 g/L.

L-leucine；Strain；Fermentation；Orthogonal Experiment

TQ922

A

1001-1463（2015）04-0007-04

10.3969/j.issn.1001-1463.2015.04.003

2015-02-11

常珠俠（1962—），女，安徽蚌埠人，高級工程師，主要從事生物工程技術研究。聯系電話：（0）18055263388。E-mail：changzhuxia6209@163.com