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低分子質(zhì)量大豆肽對斷奶仔豬胃酸分泌的影響及機制

2015-12-26 09:43:54權(quán)素玉王珊珊張源淑
食品科學(xué) 2015年21期
關(guān)鍵詞:大豆

權(quán)素玉,榮 超,王珊珊,張源淑

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物生理生化重點開放實驗室,江蘇 南京 210095)

低分子質(zhì)量大豆肽對斷奶仔豬胃酸分泌的影響及機制

權(quán)素玉,榮 超,王珊珊,張源淑*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物生理生化重點開放實驗室,江蘇 南京 210095)

目的:本實驗旨在探討大豆肽對斷奶仔豬胃酸分泌的影響及其作用機制。方法:選取剛出生的健康蘇姜豬仔豬30 頭,隨機分為對照組和大豆肽組,對照組仔豬在斷奶前常規(guī)補料,大豆肽組仔豬則補充基礎(chǔ)日糧+2%大豆肽,仔豬在21 d時一次性斷奶,分別在21 日齡與35 日齡時每組隨機取6 頭仔豬宰殺,取血液、胃黏膜及胃內(nèi)容物,對兩組所有仔豬的胃食糜pH值、血清中胃泌素含量以及胃底組織中H+-K+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶、胃蛋白酶的活性進行測定。結(jié)果:大豆肽組中,21 日齡仔豬胃內(nèi)pH值下降(由對照組的4.40±0.17降至3.94±0.38),35 日齡仔豬胃內(nèi)pH值顯著下降(由對照組的4.15±0.16降至2.89±0.06);35 日齡仔豬血清中胃泌素含量顯著升高(P<0.05),胃黏膜中H+-K+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶以及胃蛋白酶的活力均升高,但與對照組間無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論:大豆肽可促進仔豬胃酸分泌,但其作用途徑不是通過提高H+-K+-ATP/Na+-K+-ATP酶活力通路實現(xiàn),可能是通過促進胃泌素分泌直接作用于壁細胞引起的。

大豆肽;斷奶仔豬;胃酸分泌;胃泌素

近年來,蛋白水解物的營養(yǎng)價值與生物學(xué)功能已受到越來越多的重視。蛋白水解物是應(yīng)用不同種類的蛋白酶水解蛋白質(zhì)而得到的終產(chǎn)物,是由蛋白胨、多肽以及游離氨基酸所組成的混合物[1]。大豆肽是大豆蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解作用后,再經(jīng)特殊處理而得到的低肽混合物。與大豆蛋白相比,大豆肽往往具有更好的物理性質(zhì),可直接被機體吸收利用,并具有降低血壓、提高免疫力、抗氧化等作用[2-4]。

胃酸是由胃腺壁細胞分泌的鹽酸,具有激活胃蛋白酶原,為胃蛋白酶提供適宜的酸性環(huán)境,抑制和殺死隨食物進入胃內(nèi)的細菌,促進胰液、膽汁和小腸液的分泌等作用,因此,胃酸分泌對食物的消化吸收具有重要意義[5]。本實驗室前期工作證明,伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽對人和動物胃腸道優(yōu)勢菌群——雙歧桿菌具有促生長作用,并能抵抗外源大腸桿菌的感染[6-8],但大豆肽是否能夠促進機體胃酸分泌,目前仍不是很清楚。本研究擬以不同日齡斷奶仔豬為研究對象,探討大豆肽與機體內(nèi)源酸分泌的關(guān)系,闡明早期應(yīng)用大豆肽對胃酸分泌的促進作用,為挖掘大豆肽的新功能及生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù),同時,本研究對功能性食品的開發(fā)也具有一定價值。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

蘇姜豬仔豬,由泰州市姜曲海種豬場提供;基礎(chǔ)日糧,購于泰州市正大飼料有限公司。

大豆肽(分子質(zhì)量300~700 u),按照王吉莊等[9]的方法進行制備。

H+-K+-ATP酶測定試劑盒、Na+-K+-ATP酶測定試劑盒、胃蛋白酶測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;胃泌素放射免疫測定試劑盒 北京北方生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

CT15RE高速冷凍離心機 日本Hitachi公司;FMJ-182型放射免疫γ-計數(shù)器 上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠;pH計 新加坡Ecoscan公司。

1.3 實驗設(shè)計

選取胎次相近、遺傳基礎(chǔ)一致的剛出生健康仔豬30 頭(雌雄各半),隨機分為2 組(對照組和大豆肽組),對照組仔豬斷奶前常規(guī)補料,大豆肽組仔豬則補充基礎(chǔ)日糧+2%大豆肽。參照美國國家研究委員會(National Research Council,NRC)(1998)豬營養(yǎng)需要量配制基礎(chǔ)日糧,具體配方見表1。

實驗前對豬舍進行全面清洗、消毒。封閉式圈舍,分欄飼養(yǎng),固定飼喂次數(shù)、不限量,自由飲水,進行常規(guī)免疫。仔豬21 日齡時一次性斷奶。仔豬分別在21 日齡與35 日齡時分2 次屠宰,宰前禁食12 h,每組隨機取6 頭屠宰。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Basal diet composition and nutrient levels

1.4 樣品采集

血樣采集:血樣采自屠宰仔豬時的靜脈血,于室溫條件下放置,待血液凝固后,吸取上清液,4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上清液分裝存于-20 ℃冰箱備測。

胃黏膜組織采集:取胃底組織,經(jīng)生理鹽水漂洗后,液氮速凍后轉(zhuǎn)到-80 ℃冰箱保存。刮取胃黏膜,用生理鹽水1∶10(V/V)稀釋后勻漿,6 000 r/min離心30 min后取上清液,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標測定

1.5.1 胃食糜pH值的測定

參照付水廣等[10]方法,分別取21 日齡與35 日齡時分2 次屠宰仔豬的胃部,以無菌法于冰面上收集胃食糜并將適量胃食糜裝入離心管內(nèi),4 ℃、7 200×g離心25 min,用pH計測定上清液pH值。

1.5.2 血清中胃泌素含量的測定

采用放射免疫法測定仔豬血清中胃泌素的含量,操作過程全部按試劑盒說明書方法進行。

1.5.3 胃底組織中H+-K+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性的測定

樣本前處理:準確稱取仔豬胃黏膜組織100 mg放入1 mL裂解液中,冰上勻漿,12 000 r/min、4 ℃離心15 min,吸取上清液,棄去沉淀,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法[11]測定蛋白質(zhì)含量。

采用定磷法[12]測定ATP酶的活力,一個酶活力單位(U)定義為反應(yīng)體系中1 h內(nèi)ATP酶磷酸化釋放磷的含量(mmol)。ATP酶活力的具體計算方法見下式。

式中:空白組是以生理鹽水替代胃黏膜組織;標準組是以ATP酶標準品替代胃黏膜組織;6、7.8均為計算系數(shù)。

1.5.4 胃蛋白酶總活性的測定

采用Folin-酚試劑法[6],以110%牛血紅蛋白(分子質(zhì)量為64 500 u)作底物,F(xiàn)olin試劑顯色,用Backman分光光度計于680 nm波長處測定吸光度(A680nm)。

胃蛋白酶活性大小以1 g新鮮胃黏膜組織在30 ℃、pH 2.15條件下,1 min內(nèi)牛血紅蛋白經(jīng)蛋白酶分解作用所產(chǎn)生的酪氨酸(μg/mL)的量來表示。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析,差異顯著性檢驗采用單因子方差分析(one way analysis of variance,one way ANOVA),進一步進行最小顯著性差異法(least significant difference,LSD)檢驗。所有數(shù)值以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同日齡斷奶仔豬胃食糜pH值變化

圖1 不同日齡斷奶仔豬胃食糜的pH值變化(n=6)Fig.1 Comparison of pH in stomach chyme of weaning piglets of different ages (n = 6)

由圖1可知,21 日齡剛斷奶仔豬胃食糜pH值為4.40±0.17,35 日齡仔豬胃食糜pH值則降為4.15±0.16,隨著仔豬日齡的增加,胃食糜pH值稍有降低,但均高于成年豬胃食糜pH值。在日糧中添加2%大豆肽后,21 日齡剛斷奶仔豬胃食糜pH值為3.94±0.38,較對照組略有下降,斷奶2 周后(35 日齡) 仔豬胃食糜pH值降為2.89±0.06,接近成年豬的胃食糜pH值,且顯著低于同日齡對照組(P<0.05)。21、35 日齡斷奶仔豬胃食糜pH值均低于對照組,表明在日糧中添加大豆肽可以改善斷奶仔豬胃內(nèi)的酸性環(huán)境。

2.2 大豆肽對斷奶仔豬血清中胃泌素含量的影響

由圖2可知,隨著日齡的增加,仔豬血清中胃泌素含量均顯著升高。同日齡仔豬間比較發(fā)現(xiàn),在日糧中添加2%大豆肽后,仔豬血清中胃泌素含量均高于對照組,但在21 日齡時差異不顯著(對照組(19.56±1.46) pg/mL、大豆肽組(28.60±2.99) pg/mL)(P>0.05),在35 日齡時則表現(xiàn)為顯著升高(對照組(50.02±1.43) pg/mL、大豆肽組(57.19±2.41) pg/mL)(P<0.05)。

圖2 斷奶仔豬血清中胃泌素含量比較(n=6)Fig.2 Comparison of serum gastrin contents in weaning piglets of different ages (n = 6)

2.3 大豆肽對斷奶仔豬胃底組織中ATP酶和胃蛋白酶活性的影響

表2 飼喂大豆肽對斷奶仔豬ATP酶和胃蛋白酶活力的影響(n=6)Table 2 Effect of feeding soybean peptide on H+-K+-ATPase, Na+-K+-ATPase and pepsin activities in weaning piglets (n= 6)

如表2所示,隨著斷奶仔豬日齡的增加,對照組和大豆肽組斷奶仔豬胃底組織中H+-K+-ATP酶和胃蛋白酶的活性均有增加,同日齡仔豬間比較發(fā)現(xiàn),飼喂2%大豆肽后,斷奶仔豬胃底組織中H+-K+-ATP酶和胃蛋白酶的活性較對照組均有所升高,但差異均不顯著(P>0.05)。斷奶仔豬胃底組織中的Na+-K+-ATP酶的活性隨著仔豬日齡的增加有降低,飼喂大豆肽的35 日齡斷奶仔豬胃底組織中Na+-K+-ATP酶的活性較對照組有所升高,但無顯著性差異(P>0.05)。

3 討 論

由于斷奶所產(chǎn)生一系列應(yīng)激問題,使仔豬斷奶后胃酸分泌能力減弱;同時仔豬失去母乳這一乳糖源,消化道內(nèi)乳酸含量明顯下降,因此仔豬胃內(nèi)酸度在斷奶后降低,胃液pH值升高[5]。仔豬胃液pH值一般在3.5~5.5左右,而成年豬胃液的pH值為2.0左右,仔豬胃液pH值過高會導(dǎo)致胃中多種酶原(胃蛋白酶、凝乳酶及乳糖酶等)致活能力減弱,從而對飼料中各種養(yǎng)分的消化利用率降低;而且過高的胃腸pH值為病原菌(大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、梭菌等)的繁殖提供了適宜的環(huán)境;加之胃酸分泌不足引起胃排空加快,大量未經(jīng)消化的飼料涌入小腸,進入后段消化道,致使大腸桿菌大量繁殖,引起仔豬腹瀉[8-9]。有效地促進仔豬斷奶后胃酸分泌、提高其胃內(nèi)酸度是降低仔豬腹瀉、降低斷奶應(yīng)激發(fā)生的有效手段,也一直是畜牧業(yè)研究的熱點。

植物源蛋白是豬的主要日糧,但就仔豬而言,因為植物蛋白消化率較低以及含有抗原物質(zhì),因此在使用前需經(jīng)過加工來提高其應(yīng)用價值[10]。在集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中,利用植物源蛋白質(zhì)生產(chǎn)具有生物活性的小肽制劑,可以降低植物蛋白中的抗原成分,從理論和實際應(yīng)用上都可能是解決仔豬優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)原料缺乏、減輕或消除斷奶仔豬應(yīng)激綜合征的有效途徑[13]。

先前對斷奶仔豬的實驗初步證實,在日糧中添加大豆蛋白酶解物能促進仔豬生長,并能夠在一定程度上克服早期斷乳應(yīng)激反應(yīng)對仔豬消化道的不良影響[14],朱曉萍等[15]的研究表明在日糧中添加酸化劑可降低仔豬胃內(nèi)容物的pH值、提高胃蛋白酶活性,進而促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,減少仔豬腹瀉的發(fā)生。張源淑等[16]研究發(fā)現(xiàn)通過給早期斷奶仔豬添喂乳蛋白活性肽,可促進仔豬胃酸分泌。潘翠玲等[6]的研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白酶解物對21 日齡早期斷乳仔豬生長性能及消化道發(fā)育均有一定的改善作用。在本實驗中,發(fā)現(xiàn)添喂一定量的大豆肽對21 日齡和35 日齡仔豬胃酸分泌均有改善作用,仔豬胃蛋白酶活性增加,說明在日糧中添加大豆蛋白酶解物能促進仔豬胃酸分泌,并能夠在一定程度上克服早期斷乳應(yīng)激對仔豬消化道的不良影響。同時,35 日齡斷奶仔豬胃食糜的pH值降低幅度優(yōu)于21 日齡斷奶仔豬,提示長期添喂大豆肽更能有效改善仔豬胃酸分泌和胃蛋白酶活性。本實驗中,大豆肽組仔豬的胃酸分泌顯著性增加,但胃蛋白酶活性與對照組相比卻無顯著差異,這可能是大豆肽組和對照組飼料蛋白水平的差異所造成的[17]。

胃酸分泌主要受胃泌素及胃腸道中ATP酶的調(diào)節(jié)。H+-K+-ATP酶又名質(zhì)子泵,它專一性地存在于壁細胞中,是胃酸分泌的分子基礎(chǔ),也是調(diào)控壁細胞分泌胃酸的最后通道[18]。H+- K+-ATPase通過自身的磷酸化和去磷酸化,將細胞外的K+轉(zhuǎn)入細胞內(nèi),同時逆濃度梯度將細胞內(nèi)的H+泵出細胞外,完成H+/K+電中性跨膜離子轉(zhuǎn)運和胃酸分泌功能[19]。Na+-K+-ATPase又稱為鈉鉀泵,也是通過自身的磷酸化和去磷酸化在胃酸分泌過程中通過維持細胞中正常的滲透壓和穩(wěn)態(tài)[20]。胃泌素又稱為促胃液素,是由G細胞分泌的一種胃腸激素,主要刺激壁細胞分泌鹽酸,也有輕微地刺激主細胞分泌胃蛋白酶原等作用[21]。冷向軍等[22]的研究表明飼料中添加組胺可刺激仔豬胃酸分泌,顯著改善早期斷奶仔豬的生產(chǎn)性能;張源淑[23-24]和高維東[25]等研究發(fā)現(xiàn)飼喂酪啡肽可以促進斷奶仔豬的胃酸分泌,其機制是通過上調(diào)胃泌素mRNA的基因表達使胃泌素分泌增加。本實驗通過在基礎(chǔ)日糧中添加大豆肽,發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬胃液pH值降低;兩周后,35 日齡仔豬胃酸分泌能力增強,仔豬胃液pH值降為2.89±0.06,且與同齡對照組相比差異顯著。通過檢測參與胃酸分泌相關(guān)指標胃泌素活力以及H+-K+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活力發(fā)現(xiàn),大豆肽組仔豬胃底黏膜組織中H+-K+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性與對照組無明顯差異,但血清中胃泌素水平顯著升高,提示大豆肽促進胃酸分泌不是通過H+-K+-ATP/Na+-K+-ATP酶活力通路實現(xiàn)的,可能是通過促進胃泌素分泌直接作用于壁細胞引起的,其詳細機理還有待深入研究。

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Effect of Low-Molecular-Weight Soybean Peptide on the Secretion of Gastric Acid in Weaning Piglets and Its Mechanism

QUAN Suyu, RONG Chao, WANG Shanshan, ZHANG Yuanshu*
(Key Laboratory of Animal Physiology and Biochemistry, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The purpose of this study is to investigate the effect of soybean peptide on the secretion of gastric acid in weaning piglets. Thirty newborn Sujiang pigs were randomly divided into control group and soy peptide group. In the soy peptide group, 2% soybean peptide was additionally added to the basal diet. All pigs were weaned at 21 days of age. At the age of 21 days and 35 days, 6 pigs were randomly selected in each group and slaughtered. Gastric chyme pH, serum gastrin level and the enzyme activities of H+-K+-ATPase, Na+-K+-ATPase and pepsin in the stomach fundus were measured. Results: In the soy peptide group, the intragastric pH of 21-day-old piglets decreased to 3.94 ± 0.38 from 4.40 ± 0.17; the intragastric pH of 35-day-old piglets was 2.89 ± 0.06, a significant decrease compared with 4.15 ± 0.16 for control group; the serum gastrin level of 35-day-old piglets increased significantly (P < 0.05) and the enzyme activities of gastric mucosal H+-K+-ATPase, Na+-K+-ATPase and pepsin also increased but not significantly (P > 0.05). These results suggest that soybean peptide can improve the secretion of gastric acid in piglets, likely by increasing gastrin secretion which may directly act on the parietal cells rather than by enhancing the activities of H+-K+-ATPase, Na+-K+-ATPase and pepsin.

soybean peptide; weaning piglets; gastric acid secretion; gastrin

TS214.2

A

1002-6630(2015)21-0249-04

10.7506/spkx1002-6630-201521046

2015-01-12

江蘇省普通高校研究生實踐創(chuàng)新計劃項目(SJLX_0281)

權(quán)素玉(1989—),女,碩士研究生,研究方向為營養(yǎng)生物化學(xué)。E-mail:1203457176@qq.com

*通信作者:張源淑(1962—),女,教授,博士,研究方向為營養(yǎng)生物化學(xué)。E-mail:zhangyuanshu@njau.edu.cn

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讀寫算(中)(2015年10期)2015-11-07 07:24:12
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