灰霉病菌拮抗放線菌的篩選鑒定及對草莓的防腐保鮮效果

申光輝，張志清，秦 文，劉書亮，馮 孟

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

灰霉病菌拮抗放線菌的篩選鑒定及對草莓的防腐保鮮效果

申光輝，張志清，秦 文*，劉書亮，馮 孟

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

為豐富草莓采后病害拮抗菌資源，以草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）為指示菌，采用瓊脂塊法對草莓根際土壤分離的78 株放線菌進行篩選，并測定拮抗效果最強的菌株T3-5的拮抗譜。根據形態學特征、生理生化特性及16S rDNA序列進行鑒定，并初步研究其無菌發酵液對貯藏草莓腐爛發生及果實品質的影響。結果表明：草莓根際土壤分離的菌株T3-5對草莓灰霉病菌具有較強拮抗作用，拮抗圈直徑為22.5 mm；對3 株常見細菌和6 株果蔬采后病原真菌均具有不同程度的抑制效果。該菌株經鑒定為黃暗色鏈霉菌（Streptomyces xanthophaeus）。菌株無菌發酵液能夠顯著降低貯藏草莓腐爛率（P＜0.05），延緩果實硬度、可溶性固形物、可滴定酸及VC的降低。研究表明拮抗鏈霉菌T3-5對貯藏草莓具有良好的防腐保鮮作用，在草莓采后貯藏和生物保鮮中具有潛在的應用價值。

灰霉病菌；黃暗色鏈霉菌；拮抗菌；草莓；貯藏品質

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）是一種重要的漿果，營養價值高，被譽為“水果皇后”。但因含水量高，組織嬌嫩，果皮極薄，在采摘和采后貯運過程中極易受到機械損傷和病原微生物侵染而快速腐爛變質[1-2]。由灰霉病菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病害是制約草莓采后貯藏品質的主要因素之一[3]。長期以來草莓采后灰霉病的控制主要依賴于傳統的化學殺菌技術[4]，由于人們對食品安全性要求越來越高，迫切需要尋求高效、安全的新技術替代化學殺菌。近年來，氣調貯藏[5]、低溫冷藏[6]、熱激處理[7]、輻照[8]等草莓貯藏保鮮技術研究較多，但受到操作復雜繁瑣，成本較高等因素限制，仍難以替代化學殺菌在生產實踐中進行大范圍的推廣應用。

利用拮抗微生物控制果蔬采后病害的方法具有天然、安全、使用簡便、成本低等優點，有望成為傳統化學殺菌劑極具潛力的替代途徑[9-10]。拮抗放線菌代謝活性產物種類豐富，作用機制多樣，菌株抗逆性強，便于保存，利于菌劑生產和應用，在植物病害生物防治研究中受到廣泛關注。目前國內外已篩選獲得多株草莓采后病害拮抗微生物，包括細菌[11-12]、酵母菌[13-14]和霉菌[15]，而利用放線菌進行草莓采后病害防治的研究鮮見報道。本研究從草莓根際土壤中分離篩選獲得1株對草莓灰霉病菌具有較強拮抗作用的放線菌菌株T3-5，結合菌株形態特征、生理生化特性和對16S rDNA序列的鑒定，并通過貯藏實驗初步評價菌株無菌發酵液對草莓果實的防腐保鮮效果，為草莓采后病害的控制提供新的拮抗菌菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料與培養基

1.1.1 材料

豐香（Fragaria×ananassa Duch. “Toyonoga”）草莓，采自成都雙流縣草莓種植基地，挑選無病蟲害，色澤均勻，果面著色率80%左右，大小相近且無損傷的果實用于實驗，采后立即運回實驗室處理。

1.1.2 菌株

草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）17312由中國農業微生物菌種保藏管理中心提供；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、番茄果腐病菌（Penicillium expansum）、冬棗黑腐病菌（Alternaria alternata）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、枇杷褐斑病（Pestalotiopsis eriobotryfolia）、桃軟腐病菌（Rhizopus stolinifer）、蘋果輪紋病菌（Botryospuaeria berengeriana）均由四川省農產品貯藏與加工重點實驗室保存。

1.1.3 培養基

高氏一號培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextroseagar agar，PDA）、營養瓊脂培養基（nutrient agar，NA）、國際鏈霉菌計劃（International Streptomyces Projects，ISP）系列形態特征培養基與生理生化鑒定培養基 青島海博生物技術有限公司。

1.2 試劑與儀器

細菌基因組提取試劑盒、DL 2000 DNA Marker、溶菌酶 天根生化科技（北京）有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、16S rDNA通用引物及其相關試劑 英濰捷基（上海）貿易有限公司。

Satorius CP225D型電子天平 德國賽多利斯公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；SHP-160型智能生化培養箱 上海三發科學儀器有限公司；Sorvall離心機 美國科俊儀器有限公司；Milli-Q超純水系統 美國Millipore公司；MyCycler PCR儀、PowerPac Basic電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；ZWY-2102C恒溫培養振蕩器上海智誠分析儀器制造有限公司；HYC-260型醫用冷藏箱 青島海爾特種電器有限公司；GY-1型硬度計 浙江托普儀器有限公司；PX-B32T型水果糖度儀（ATC）廣州市普析通儀器有限公司；UV-3100PC型紫外分光光度計 上海美普達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 拮抗菌的分離純化

以種植基地獲取的12 份草莓根際土壤為分離源，采用平板稀釋分離法進行放線菌分離。土樣梯度稀釋至10－3、10－4、10－5，每稀釋度吸取0.25 mL涂布于高氏一號平板培養基上（K2Cr2O7質量濃度為80 mg/L），28 ℃倒置培養3～5 d。挑取形態各異的放線菌單菌落進行劃線分離純化，接種于高氏一號斜面培養基，28 ℃培養5 d，4 ℃保存備用。

1.3.2 拮抗菌的篩選及拮抗譜測定

拮抗放線菌菌株篩選采用瓊脂塊法。將待篩菌株涂布于高氏一號平板培養基，28 ℃培養7 d，用無菌打孔器打孔制備直徑7 mm的菌株瓊脂塊。草莓灰霉病菌孢子懸液涂布于PDA平板培養基，待篩放線菌瓊脂塊均勻置于平板培養基上，25 ℃培養3 d，用十字交叉法測量并記錄拮抗圈大小，每株待篩放線菌重復3 次。拮抗譜測定同上述瓊脂塊法。

1.3.3 拮抗菌T3-5的鑒定

拮抗菌株的形態特征及生理生化特性的鑒定參照《鏈霉菌鑒定手冊》[16]方法進行，并與《放線菌的分類和鑒定》[17]中相關菌株特征進行比較。

16S rDNA序列分析采用細菌基因組提取試劑盒提取T3-5菌株基因組DNA。采用通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’進行菌株16S rDNA PCR擴增。PCR產物電泳檢測回收，交上海立菲生物技術有限公司純化并測序。利用美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫中BLAST程序對所測序列進行比對分析，選擇GenBank中與之同源性較高菌種的模式菌株16S rDNA序列，利用Clustal X1.8軟件對其進行多重比對，分析菌株T3-5與參比菌株之間的序列相似度，并通過Mega5.1軟件，選擇Kimura 2-parameter模型，構建菌株Neighbor-Joining（N-J）系統發育樹，并進行Bootstrap分析檢驗，重復1 000 次。

1.3.4 T3-5無菌發酵液對草莓貯藏品質的影響

將T3-5在高氏一號平板培養基上培養5 d后，接種于高氏一號液體發酵培養基中，28 ℃、140 r/min條件培養8 d。發酵液4 ℃，12 000 r/min離心，上清液經0.22 μm細菌過濾器過濾獲得無菌發酵液，用無菌生理鹽水稀釋至體積分數分別為5%、10%、20%無菌發酵稀釋液備用。

將供試草莓隨機分成4 組，其中3 組分別用體積分數5%、10%、20%無菌發酵稀釋液浸果處理1 min，余下一組用生理鹽水浸果處理作為對照組。果實室溫晾干，裝入一次性包裝盒，每盒10 個果實，PE保鮮膜覆蓋好，貯藏于（4±1） ℃，相對濕度 90%～95%條件下。每處理組重復30 盒，其中15 盒用于統計果實腐爛指數，另外15 盒中每隔48 h隨機選取3 盒測定其他指標。

1.3.5 果實腐爛指數測定

各處理組每隔48 h取3 盒草莓觀察腐爛情況，參照羅自生等[18]的方法，將草莓果實腐爛率按照腐爛面積占果面比例大小劃分為5 級：0 級，無腐爛；1 級，腐爛面積≤10%；2 級，腐爛面積10%～30%；3級，腐爛面積30%～50%；4 級，腐爛面積＞50%。

1.3.6 草莓果實品質指標測定

硬度采用果實硬度計測定；可溶性固形物用手持折光儀測定；可滴定酸采用NaOH溶液滴定法測定（以檸檬酸計）；VC含量采用分光光度法測定，以上指標均參考曹建康等[19]方法進行。

1.4 數據處理

采用Origin 9.0統計軟件進行各處理組數據結果的平均值、標準偏差及方差分析（analysis of variance，ANOVA），采用Duncan’s新復極差法進行不同處理組結果差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗放線菌菌株的分離篩選

圖1 T3-5菌株對草莓采后灰霉病菌（）的拮抗作用Fig.1 Antagonistic effect of strain T3-5 on Botrytis cinereaB. cinerea

從10 份土壤樣品中分離獲得78 株放線菌，通過篩選獲得5 株對草莓灰霉病菌具有拮抗作用的放線菌菌株，其中菌株T3-5對草莓灰霉病菌的拮抗圈直徑達22.5 mm（圖1）。該菌株具有較廣的拮抗譜，對常見細菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及番茄果腐病菌等6 種果蔬采后病原菌具有較強拮抗效果，結果見表1。

表1 菌株T3-5對草莓灰霉病菌及其他供試菌的拮抗作用Table 1 Inhibitory effect of strain T3-5 against the tested pathogens

2.2 拮抗菌株T3-5的鑒定

2.2.1 菌株培養特征、顯微形態及生理生化特性

菌株T3-5在高氏一號培養基上氣生菌絲呈灰白色至紫灰色，基內菌絲淺黃色至黃褐色，呈地衣狀，產少量淺黃色可溶性色素（圖2A）。在PDA、ISP2、ISP3、ISP4和ISP5培養基上氣生菌絲分別呈灰色、灰黃粉色、灰黃紅色、淺灰褐色和白色，基內菌絲分別為灰色、淺灰黃色、灰黃色、暗褐色和淺黃色，除PDA培養基外均可產少量淺黃色可溶性色素。光學顯微鏡下觀察到菌株T3-5菌絲無橫隔，孢子絲直，柔曲，孢子直鏈排列，球形至卵圓形（圖2B）。菌珠T3-5的生理生化特征見表2。

圖2 T3-5菌株在高氏一號培養基上的培養特征（A）與光學顯微鏡下的形態特征×400（B）Fig.2 Cultural characteristics (A) and morphological characteristics (B) of strain T3-5 on Gauze’s medium No. 1

表2 菌株T3-5生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain T3-5

2.2.2 菌株16S rDNA序列分析

以菌株T3-5基因組DNA為模板，采用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果見圖3，測序獲得菌株16S rDNA基因片段的長度為1 424 bp。經NCBI數據庫BLAST工具比對分析發現，菌株T3-5的16S rDNA序列（GenBank登錄號：KP869098）與黃暗色鏈霉菌（Streptomyces xanthophaeus）XSD-129（GenBank登錄號：EU285474）序列相似度為100%，此外與GenBank中鏈霉菌屬內多個種的菌株序列相似度大于99.5%。選取13 株相似度較高的鏈霉菌屬不同種模式菌株的16S rDNA序列與T3-5菌株序列構建系統發育樹，結果顯示菌株T3-5與黃暗色鏈霉菌（S. xanthophaeus），野尻鏈霉菌（S. nojiriensis）和孢淡灰鏈霉菌（S. spororaveus）3 種不同鏈霉菌的模式菌株聚在同一分支（圖4），且序列相似度均為99.86%。說明這3 種鏈霉菌在進化過程中親緣關系密切，但利用16S rDNA序列分析不能將菌株T3-5鑒定到種。因此，結合在2.2.1節獲得的菌株培養特征、生理生化特性（表2）與《放線菌的分類和鑒定》[17]中這3 個種的特征描述進行比較，發現菌株T3-5孢子絲直形，與野尻鏈霉菌的緊密螺旋形孢子絲特征不符。此外孢淡灰鏈霉菌明膠不液化，纖維素生長利用的生理特性與待鑒定菌株不符。然而，菌株T3-5的其他生理生化結果與黃暗色鏈霉菌相符合，因此初步將菌株T3-5鑒定為黃暗色鏈霉菌。

圖3 菌株T3-5的16S rDNA序列PCR產物電泳圖Fig.3 PCR electrophoresis map based on 16S rDNA sequence of strain T3-5

圖4 基于16S rDNA序列構建的菌株T3-5系統發育樹Fig.4 Phylogenetic neighbor-joining tree based on 16S rDNA sequences of strain T3-5 and related strains from GenBank database

2.3 拮抗菌株T3-5無菌發酵液對草莓貯藏品質的影響

2.3.1 果實腐爛指數和硬度變化

圖5 T3-5無菌發酵液對4 ℃貯藏草莓腐爛指數（A）和硬度（B）的影響Fig.5 Effect of cell-free fermentation filtrate of strain T3-5 on decay rate (A) and firmness (B) of strawberry fruits stored at 4 ℃

如圖5A所示，4 ℃貯藏條件下各處理組草莓腐爛指數隨著貯藏時間呈逐漸上升趨勢，其中對照組果實腐爛指數上升最快，第10天時腐爛指數已達50.8%。貯藏第6～10天，菌株T3-5不同體積分數無菌發酵液處理組草莓果實腐爛指數均顯著低于對照組（P＜0.05），且體積分數越高，抑制效果越好；其中20%體積分數無菌發酵液處理組草莓在貯藏第10天的腐爛指數為28.7%，較對照組降低了43.5%。果實硬度降低是草莓貯藏期品質變劣的主要變現。由圖5B可知，隨著貯藏時間延長，各處理組草莓果實硬度均逐漸下降，對照組果實硬度下降最快。菌株T3-5不同體積分數無菌發酵液處理組草莓果實硬度較對照組下降較慢；其中20%體積分數發酵液處理組果實硬度下降最慢，至貯藏第10天，果實硬度為382 g/cm2，較對照組高13.1%。

2.3.2 果實可溶性固形物、可滴定酸、VC含量變化

由圖6A可見，在4 ℃貯藏條件下，各處理組草莓可溶性固形物含量呈現先升后降的趨勢。對照組果實可溶性固形物在貯藏第4天達到峰值，之后快速下降，至貯藏第10天果實可溶性固形物較貯藏初始降低了4.7%。菌株T3-5不同體積分數無菌發酵液處理組果實可溶性固形物峰值出現時間均較對照組延遲，且之后降低較為緩慢，貯藏第6天之后果實可溶性固形物含量均顯著高于對照組（P＜0.05）；其中20%體積分數發酵液處理組果實在第8天才達到峰值，貯藏第10天可溶性固形物含量較貯藏初始增加了3.1%。

由圖6B可知，各處理組草莓果實在4 ℃條件貯藏下可滴定酸含量均呈逐漸下降趨勢。對照組果實可滴定酸下降速率最快，從第6天開始迅速降低，第10天果實可滴定酸含量較貯藏期初始下降了14.4%。菌株T3-5無菌發酵液處理可延緩貯藏期果實可滴定酸含量的下降，且隨著發酵液體積分數的增加，延緩作用越強。貯藏期第6～10天，不同濃度發酵液處理組果實可滴定酸含量顯著高于對照組（P＜0.05）；其中20%體積分數發酵液處理組果實貯藏第10天可滴定酸含量較對照組高5.4%。

由圖6C可知，各處理組草莓果實VC含量變化規律與可滴定酸類似。貯藏第10天，對照組果實VC損失率達52.9%。菌株T3-5無菌發酵液處理可延緩4 ℃貯藏果實VC的損失，其中20%體積分數發酵液處理組果實VC在貯藏第10天損失率為33.1%，損失率較對照組減少了19.8%。

圖6 T3-5無菌發酵液對4 ℃貯藏草莓可溶性固形物（A）、可滴定酸（B）和VC含量（C）的影響Fig.6 Effect of cell-free fermentation filtrate of strain T3-5 on soluble solid (A), titratable acid (B) and vitamin C contents (C) of strawberry fruits stored at 4 ℃

3 討 論

近年來國內外利用拮抗菌進行草莓采后保鮮研究發展較快，獲得了多株對草莓采后病原菌具有較好拮抗作用及防腐保鮮效果的微生物菌株，主要以細菌和酵母菌為主[11-14]。放線菌種類繁多，代謝產物豐富多樣，是一類重要的微生物資源。在食品防腐保鮮領域成功廣泛應用的抗菌多肽ε-多聚賴氨酸和納他霉素均由放線菌發酵生產[20]，并逐漸被應用于果蔬采后保鮮研究[21]。為豐富用于果蔬采后病害控制的放線菌資源，近年來相關學者也開展了不少的篩選研究工作，并顯示出良好的開發利用潛力：如婁愷等[22]篩選獲得1 株鏈霉菌H2菌株，對哈密瓜采后優勢腐敗菌交鏈孢霉具有較強拮抗作用；Li Qili等[23]發現球孢鏈霉菌（S. globisporus）揮發性代謝產物對番茄灰霉病菌生長和孢子萌發均具有較強的抑制作用，活體實驗表明對番茄灰霉病防效良好；鹿連明等[24]從29 份海洋生物中分離篩選獲得1 株米修鏈霉菌（S. misionensis），對柑橘青霉病菌、柑橘綠霉病菌和柑橘炭疽病菌具有較強拮抗作用和良好的防治效果。本研究獲得的鏈霉菌T3-5菌株對草莓采后灰霉病菌具有較強拮抗作用外，對番茄果腐病菌等指示菌也具有較強抑菌效果，表明該菌株具有較廣的拮抗譜，在果蔬采后病害防治上值得深入研究。同時也顯示出豐富的放線菌資源在果蔬采后病害防治方面的巨大潛力。

16S rDNA序列是微生物分類鑒定研究中快速、準確的重要方法[25]。本研究通過16S rDNA測序分析發現，菌株T3-5與GenBank中3 個高度同源而又分屬不同種的模式菌株的序列相似度大于99.5%，同時也聚類在構建系統發育樹同一分支，無法準確有效將T3-5鑒定到種。其他研究[26-28]也發現了16S rDNA序列在鑒定同源性很高的菌種過程中也存在類似的局限性，需要結合表觀、生理生化特征等其他多相分類方法[27-28]或其他分子生物學方法作為補充進行鑒定[28]。本研究最終通過菌株形態、生理生化特性和16S rDNA序列將菌株T3-5初步鑒定為黃暗色鏈霉菌。因此，盡管16S rDNA序列分析技術已經比較成熟和完善，但傳統的形態與生理生化特征仍是微生物菌種分類鑒定工作中必不可少的手段。

草莓果實4 ℃貯藏過程中可溶性固形物、可滴定酸、VC含量在貯藏第4天顯著降低，而果實腐爛指數與硬度在第6天發生較大幅度變化，這可能與營養物質變化與果實軟化腐爛的生理生化過程差異有關。草莓采后可溶性固形物、可滴定酸的損失，主要與其作為果實呼吸代謝底物消耗有關[29]，此外腐敗菌侵染也會消耗果實部分糖類物質；而草莓采后果實硬度下降主要與果膠降解相關酶活性升高，內源激素水平變化，導致胞壁結構瓦解有關[30]。草莓果實受到腐敗菌侵染，開始消耗果實糖類物質到大量繁殖，并表現出腐爛癥狀也要經歷一系列變化過程，因此表現出果實腐爛指數的急劇變化時間晚于營養物質變化時間。

國內外關于黃暗色鏈霉菌的研究報道較少，其發酵產物成分主要在醫藥研究領域作為β-半乳糖苷酶和焦谷氨酰肽酶抑制劑等[31-32]。而關于黃暗色鏈霉菌在植物病害及果蔬采后病害防治方面鮮有報道。本研究發現菌株T3-5無菌發酵液對低溫貯藏草莓腐爛的發生具有良好的抑制效果，且對草莓果實品質具有較好的維持作用，能夠延緩果實硬度降低，延緩可溶性固形物、可滴定酸消耗和VC成分的損失，進一步表明該菌株在草莓采后保鮮實踐方面具有一定的開發價值。但本實驗僅對T3-5菌株應用于草莓采后灰霉病控制及保鮮效果進行了初步探究，要將其最終應用于生產實踐中，還需對其發酵液活性成分進行分離鑒定，并對其抑菌作用機理，拮抗菌發酵液、病原菌與果實間互作效應及菌株生產利用方式進一步研究探索。

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Identification of Antagonistic Actinomyces Strain against Botrytis cinerea and Effect of Its Fermentation Filtrate on Preservation Quality of Strawberry

SHEN Guanghui, ZHANG Zhiqing, QIN Wen*, LIU Shuliang, FENG Meng
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

In order to obtain more antagonists for controlling postharvest strawberry disease, Botrytis cinerea was used as an indicator strain to screen antagonistic actinomyces out of 78 strains isolated from strawberry rhizosphere. The inhibitory spectrum of antagonistic strain T3-5 was tested by agar block method, and the effect of its cell-free fermentation filtrate on postharvest decay and quality of fresh strawberry fruits was assessed. The results showed that strain T3-5 had the strongest inhibitory effect on B. cinerea and six other selected postharvest pathogens, and the diameter of inhibitory zone against B. cinerea was 22.5 mm. Based on its morphological characteristics and 16S rDNA sequence, the antagonistic strain T3-5 was primarily identified as Streptomyces xanthophaeus. Its cell-free fermentation filtrate significantly (P ＜ 0.05) decreased the incidence of strawberry fruit rot. In addition, assays demonstrated that T3-5 filtrate treatment could slow down the decline of postharvest strawberry fruit firmness, soluble solid content, titration acid content and vitamin C content during storage period. Conclusively, the antagonistic strain T3-5 has potential value in biological control against strawberry postharvest diseases.

Botrytis cinerea; Streptomyces xanthophaeus; antagonistic strain; strawberry; storage quality

S476；Q939.9

A

1002-6630（2015）21-0185-06

10.7506/spkx1002-6630-201521035

2015-02-04

四川省教育廳青年基金項目（13ZB0288）；國家公益性行業（農業）科研專項（201303073）

申光輝（1985—），男，講師，博士，研究方向為食品微生物資源與利用。E-mail：shenghuishen@163.com

*通信作者：秦文（1967—），女，教授，博士，研究方向為果蔬采后生理及貯藏技術。E-mail：qinwen1967@yahoo.com.cn