白魚腐敗細菌的分離與鑒定

夏秀東，劉小莉，王 英，李 瑩，董明盛，周劍忠,*

（1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

白魚腐敗細菌的分離與鑒定

夏秀東1，劉小莉1，王 英1，李 瑩1，董明盛2，周劍忠1,*

（1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

通過對不同溫度條件下白魚（Anabarilius）菌落數量的統計發現， 與37 ℃相比，25 ℃培養條件更有利于白魚攜帶細菌的生長，也更容易導致白魚的腐敗。通過對分離自腐敗的白魚中21 株細菌的16S rDNA序列分析后，最終確定得到了11 株不同的菌株。同時結合生化鑒定結果，將這些菌種分屬7 個不同的屬：2 株摩根氏菌（Morganella），3 株變形桿菌（Proteus），2 株漫游球菌（Vagococcus），1 株葡萄球菌（Staphylococcu），1 株泰瑞芽孢桿菌（Terribacillus），1 株賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus），1 株透明顫菌（Vitreoscilla）。其中摩根氏菌和變形桿菌同屬腸桿菌科，是腐敗白魚的優勢菌，可能是白魚的特定腐敗菌 （specific spoilage organisms，SSO）。

白魚；腐敗菌；分離；16S rDNA；鑒定

魚類腐敗指的是魚體在微生物的作用下蛋白質、氨基酸及其他含氮化合物被分解為氨、組胺、吲哚、三甲胺、硫化氫等小分子物質使魚體產生臭味的過程[1]。魚體的腐敗一般要經歷如下階段[2]：第1階段，機體自身酶系統作用的過程，發生僵硬現象；第2階段，一段時間后，機體逐漸恢復原來的柔韌度；第3階段，機體中或者黏附侵入的細菌就會大量繁殖，分泌大量水解酶例如蛋白酶、脂酶、核酸酶，以及脫羧酶類如組氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶等加速了機體的進一步分解。第3階段是魚體真正發生腐敗變質的過程。

尋找導致水產品腐敗的微生物種類，才能有效進行水產品腐敗的靶向抑制，是研發水產品加工保藏技術、提高水產品質量的前提。對水產食品腐敗微生物長期研究發現，水產品所含微生物中只有部分微生物參與腐敗過程，因此提出了特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）的概念[3]。目前對魚類特定腐敗菌的研究主要集中在對假單胞菌（Pseudomonas spp.）與腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）的研究[4]。由于魚的種類、生活水域、捕獲季節、貯藏條件等的不同，導致魚體所攜帶的微生物組成復雜多樣。因此，有必要對不同魚種和不同的運輸、加工、貯藏條件進行特定腐敗菌研究，以確定其特定腐敗菌，從而有效實施靶向抑制。本研究通過對腐敗后的白魚（Anabarilius）中的細菌進行計數并對分離得到的細菌進行分子生物學和生化鑒定，旨在確定導致白魚腐敗的可能SSO，為改進水產品的加工保藏技術和延長白魚產品的貨架期提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白魚購自江蘇省南京市玄武區孝陵衛菜市場。

PCA（plate count agar）瓊脂培養基 上海盛思生化科技有限公司；MRSA（man rogosa sharpe medium agar）、MSA（mannitol salt agar）和GTA（glucose tryptone agar）瓊脂培養基 北京路橋技術有限責任公司；VRBDA（violet red bile dextrose agar）瓊脂培養基北京奧博星生物技術有限責任公司；TIANamp Bacteria DNA kit 天根生化科技（北京）有限公司；Premix TaqTM日本TaKaRa公司；細菌生化鑒定管 青島海博生物技術有限公司。

hJ-3型數顯恒溫磁力攪拌器 國華電器有限公司；SX-500-TOMy高壓滅菌鍋 日本Tomy公司；SIGMA 3K15離心機 美國Sigma公司；Jy300C型電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司；THZ-C-1型臺式全溫振蕩器 蘇州培英實驗設備有限公司；CRh-150生化培養箱 上海一恒科技有限公司；yS100型生物顯微鏡 日本Nikon公司；Sw-CJ-K型雙人單面凈化工作臺蘇州華宏凈化技術有限公司；S1000TMThermal Cycler美國Bio-Rad公司；JT-B均質器 河南兄弟儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 白魚前處理及取樣

白魚每尾500～600 g，充氧保活帶回實驗室，立即冰水休克致死，去鱗，解剖去除內臟，洗凈，瀝水，分割成5 cm×5 cm大小的魚塊，置于滅菌的500 mL錐形瓶中，放置于25、37 ℃培養箱中直至完全腐敗。于超凈臺中取鮮白魚、放置3 d和5 d的白魚樣品進行菌落計數。

1.2.2 平板計數及細菌分離

參照hu等[5]實驗方法，無菌條件下取白魚樣品（25±1） g于滅菌的勻漿杯中，加入225 mL 0.8%無菌生理鹽水，充分研磨后轉移到滅菌的500 mL三角瓶中，于20 ℃、200 r/min振搖30 min，靜置15 min自然沉淀。上清液用0.8%生理鹽水以10 倍梯度稀釋，選3 個合適的梯度液，各取0.1 mL的稀釋液傾注在不同的選擇性培養基上培養1～2 d，以測定樣品中不同細菌的數量，每個樣品做3 個平行。菌落總數用PCA瓊脂培養基進行統計；葡萄球菌和微球菌（Micrococcaceae）用MSA瓊脂培養基進行統計；芽孢桿菌（Bacillus）用GTA瓊脂培養基進行統計；腸桿菌（Enterobacteriaceae）用VRBDA瓊脂培養基進行統計；乳酸菌數用MRSA瓊脂培養基進行統計，測定菌落數。 同時，根據菌落的形狀、大小和顏色等外觀特征，挑取在25 ℃條件下放置5 d的白魚的細菌篩選培養基上的單菌落進行分離純化和進一步鑒定。

1.2.3 生化鑒定

對純化得到的菌株進行形態特征鑒別、革蘭氏染色、過氧化氫酶實驗、利用葡萄糖產氣實驗，然后進一步進行生化鑒定，實驗參考《常用細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》第9版，用細菌生化微量鑒定管進行。

1.2.4 細菌基因組DNA的提取

將1.2.2節分離得到的細菌菌株接種于液體細菌培養基（0.5%蛋白胨、0.25%酵母粉、0.1%葡萄糖），ph 7.0±0.1中培養至對數生長末期，4 ℃、12 000 r/min離心2 min收集菌體。使用TIANamp Bacteria DNA kit（Cat.#:DP302-02）基因組提取試劑盒抽提基因組DNA。

1.2.5 16S rDNA的擴增、測序及基因登錄號的獲得

以16S rDNA基因的通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）為引物，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增菌株的16S rDNA基因。反應體系為50 μL：Premix TaqTM（Ex TaqTMVersion2.0 plus dye, Cat.#:RP902A）25 μL；正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，加無菌去離子水補至50 μL。PCR反應程序如下：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33 個循環；72 ℃延伸5 min。確定擴增片段長度與目的片段長度相同、無雜帶后送至生工生物工程（上海）股份有限公司直接測序，測序引物與擴增引物相同，測序長度為1 500 bp左右。將測得的DNA序列提交至GenBank（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）獲得基因登錄號。

1.2.6 基于16S rDNA基因序列的系統發育樹構建

采用DNAMAN 6.0軟件對測序所得的16S rDNA基因序列進行兩兩比對，序列相似度≥99.9%的視為同一株菌，選取其中一條代表序列進行后續分析；采用BLAST Search在線分析，找出各代表序列在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫中最近緣種的模式菌株序列、編號及基因登錄號；利用MEGA 5.10中的Clustal w程序對16S rDNA基因序列進行多序列比對，采用Neighbor-Joining方法構建系統發育進化樹，其中Bootstrap為1 000 個重復。

1.3 統計分析

實驗數據運用SPSS 10中的One-way ANOVA進行分析，不同的小寫字母代表處理間存在顯著性差異（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 新鮮及腐敗后的白魚細菌統計

為研究白魚腐敗后細菌總數及不同類型細菌的數量，本實驗將去鱗、去頭、去內臟后清洗干凈的白魚分別置于25、37 ℃條件下，在第3天和第5天分別取樣。樣品經處理后用不同的選擇性培養基對細菌進行統計。

表1 新鮮及腐敗后的白魚細菌數Table 1 Colony counts of fresh and putrid whitefish lg（CFU/g）

如表1所示，新鮮白魚細菌總數為4.22（lg（CFU/g）），其中腸桿菌（生長于VRBD瓊脂培養基上的細菌）數最多達到了4.06 （lg（CFU/g）），構成了新鮮白魚主要的初始污染菌。3 d后，培養于25 ℃條件下的白魚細菌總數達到了9.42 （lg（CFU/g）），顯著高于37 ℃培養條件下腐敗白魚的細菌總數且優勢菌依然為腸桿菌（生長于VRBD瓊脂培養基上的細菌）。5 d后，培養于25 ℃條件下的腐敗白魚的細菌總數與第3天相比沒有顯著性差異，而培養于37 ℃條件下的腐敗白魚的總細菌數相較于第3天增加到將近10 倍，與培養于25 ℃條件下的腐敗白魚的細菌總數相當。這說明與37 ℃的培養條件相比25 ℃更適宜白魚腐敗菌的生長，也更容易導致白魚的腐敗。特別是25 ℃條件下腐敗白魚中的乳酸菌（生長于MRS瓊脂培養基上的細菌）數量與新鮮白魚相比有顯著增加，而37 ℃條件下腐敗白魚中卻檢測不到乳酸菌，這說明新鮮白魚攜帶的乳酸菌對溫度非常敏感，且更適宜在25 ℃條件下生長。產生以上結果的原因可能是由于白魚主要生活在中溫環境中，其攜帶的細菌也更加適宜在中溫條件下生長。

同時，表1結果表明無論新鮮白魚還是不同培養條件下的腐敗白魚，腸桿菌都是優勢細菌。葡萄球菌和微球菌（生長于MSA瓊脂培養基上的細菌）以及芽孢桿菌（生長于GTA瓊脂培養基上的細菌）的數量總是比腸桿菌的數量少1～2 個數量級，并不是腐敗白魚的優勢細菌。

2.2 分離菌DNA的16S rDNA序列分析

圖1 分離菌的16S rDNA擴增產物電泳圖Fig.1 Electropherogram of PCR amplification products of 16S rDNA from 21 isolates

從不同的培養基上挑取了21 個單菌落進行純化。為了對分離菌進行分子生物學鑒定，提取了21 株細菌的基因組DNA，并擴增其16S rDNA部分序列。如圖1所示，21 株腐敗白魚分離細菌均能獲得單一且與預計大小吻合的擴增條帶。

表2 分離菌的16S rDNA序列分析Table 2 Analysis of 16S rDNA sequences from 21 isolates

圖2 白魚分離細菌16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strains isolated from whitefish based on 16S rDNA sequences

如表2和圖2結果所示，經DNAMAN 6.0 軟件進行兩兩比對分析發現最初分離的21 個菌株實際只有11 株不同的菌株，分屬Morganella sp.、Proteus sp.、Vagococcus sp.、Bacillus sp.、Terribacillus sp.、Staphylococcus sp.、Vitreoscilla sp. 7 個不同的屬。同時，將測序結果提交至Genbank獲得了對應的基因登錄號。

在11 株菌中Morganella sp.wf-1、Morganella sp.wf-2、Proteus sp.wf-1、Proteus sp.wf-2、Proteus sp.wf-3、Vagococcus sp.wf-1、Vagococcus sp.wf-2、Terribacillus sp. wf-1、Lysinibacillus sp. wf-1和Staphylococcus sp. wf-1與相似度最高的菌株相似度均達到99%以上，可以確定它們與相似度最高的菌株為同一種類。Vitreoscilla sp. wf-1與分離自人類牙齒菌斑的Vitreoscilla stercoraria strain Gottingen 1488-6相似度最高，然而相似度只有95%。

2.3 分離菌的生化鑒定

對分離得到的11 株細菌進行革蘭氏染色、形態觀察以及產氣實驗、h2O2酶活性檢測、糖利用實驗、氧化酶活性實驗、明膠液化實驗、h2S產生實驗、尿素利用實驗和吲哚產生實驗，如表3所示，Morganella sp.wf-1和Morganella sp.wf-2符合摩根氏菌的生化特性；Proteus sp.wf-1、Proteus sp.wf-2和Proteus sp.wf-3符合變形桿菌的生化特性，Vitreoscilla sp. wf-1符合透明顫菌的生化特性；Vagococcus sp.wf-1和Vagococcus sp.wf-2符合漫游球菌的生化特性；Terribacillus sp. wf-1和Lysinibacillus sp. wf-1符合芽孢桿菌的生化特性；Staphylococcus sp. wf-1符合松鼠葡萄球菌的生化特性。這一結果與利用16S rDNA鑒定的結果一致。

表3 分離菌的部分生化鑒定結果Table 3 Biochemical tests of 11 bacterial isolates

結合表1～3的結果顯示：Proteus sp. wf-1、Proteus sp.wf-2和Proteus sp. wf-3以及Morganella sp. wf-1和Morganella sp. wf-2分離自VRBDA瓊脂培養基，而生長于VRBDA瓊脂培養基上的細菌構成了腐敗白魚優勢細菌，所以Proteus sp. wf-1、Proteus sp. wf-2、Proteus sp. wf-3、Morganella sp. wf-1和Morganella sp. wf-2中的一種或幾種細菌可能是白魚的SSO，這需要進一步實驗來進行驗證。

3 討 論

導致水產品腐敗的因素很多。總體而言可以劃分為內在因素和外在因素[2]。內在因素主要包括水產品較高的水分活度、高蛋白質、含有較高的微生物等；外在因素主要有貯存、運輸和加工過程中溫度、微生物控制、防腐劑的選擇等。其中微生物是導致水產品腐敗的根本因素，微生物活動不僅能使水產品發生變質，而且還能合成一些導致消費者過敏的物質，例如生物胺類物質，而組胺是生物胺中對人類健康影響最大的一種[6]。當人體攝入過量的組胺時，會引起頭痛、惡心、心悸、血壓變化、呼吸紊亂等不適癥狀，嚴重時還會危及生命。

本研究結果顯示腐敗白魚優勢微生物為摩根氏菌（Morganella）和變形桿菌（Proteus）（表1和表3），它們同屬于腸桿菌科。摩根氏菌和變形桿菌是魚類腐敗過程中常見的腐敗菌，在自然界中分布廣泛，主要存在于水、腐敗有機物中以及動物腸道中[7-8]。能夠代謝氨基酸的微生物在魚類食品中非常普遍。這類微生物主要是一類能產生氨基酸脫羧酶的微生物，其中以能產生組氨酸脫羧酶的組胺產生菌危害最為嚴重。

據報道摩根氏菌（Morganella）廣泛存在于水產中，具有很強的組胺產生能力，在食品腐敗過程中能通過分泌組氨酸脫羧酶催化組氨酸生成組胺，高含量組胺食品常常會使消費者出現過敏中毒癥狀[9-10]。更嚴重的是摩根氏菌（Morganella）是一種條件致病菌，會導致人類、爬行動物、海豹以及其他一些動物的感染[11]。此外，本研究分離得到的兩株摩根氏菌均為產氣菌（表2），而產氣菌是導致真空包裝產品脹袋的主要原因，所以研究抑制摩根氏菌的方法，對延長白魚真空產品的貨架期具有重要的意義。

變形桿菌（Proteus）也是一種較強組胺產生菌，同時也是一種條件性致病菌[12]，其引起的食物中毒是一種常見的細菌食物中毒[13]。其中有的是由于活菌隨同食物進入胃腸道，并在小腸中生長繁殖引起感染，引發感染型急性胃腸炎；有的是由于某些變形桿菌屬能產生腸毒素，引起毒素型急性胃腸炎；有的是由于能產生較強活性的脫羧酶，將食品中的組氨酸脫酸形成組胺而引起過敏性組胺中毒。除此以外變形桿菌還會引起如呼吸道感染、泌尿道感染、創傷及燒傷感染、肺炎、腸炎、慢性中耳炎、腦膜炎等多種感染。

國內外關于水產品SSO的研究主要集中在假單胞菌（Pseudomonas spp.）與腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens），然而，不同水產品及同一水產品在不同條件下的SSO有可能是不一樣的[14]，因而，有必要對不同的水產品及不同條件下的水產品的SSO進行研究。鑒于本研究中分離得到的摩根氏菌（Morganella）和變形桿菌（Proteus）是腐敗白魚的優勢細菌，且它們又是水產品重要的致腐致病菌，因此，摩根氏菌（Morganella）和變形桿菌（Proteus）很有可能就是白魚的SSO，應當受到足夠的重視。

松鼠葡萄球菌是最古老的葡萄球菌之一[15]，廣泛存在于自然環境中，如寵物、野生動物的皮膚和黏膜表面，沙石，土壤，水及沼澤中，但在水生動物中分離得到的報道較少[16]。在本研究中分離到一株葡萄球菌（Staphylococcus sp. wf-1），經16S rDNA鑒定其與松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri strain LH-T3）的相似度最高，達到了99.38%（表2）。作為條件致病菌，在危險因素存在的情況下，松鼠葡萄球菌可以引起心內膜炎，尿路感染，腹膜炎，骨盆炎，膿毒血癥休克，眼內炎，最常見的為傷口感染。據統計，在凝固酶陰性的葡萄球菌中，由松鼠葡萄球菌引起的感染約占0.79%～4.3%[17]。因此，雖然松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）并不是腐敗白魚的優勢菌，也應受到一定的重視。

漫游球菌（Vagococcus）的模式種是河流漫游球菌（Vagcoccus fluvialis），由于漫游球菌在進化和表型上與腸球菌和乳酸乳球菌非常相似，因此在進行形態學鑒別和生化實驗時容易混淆，通過16S rDNA和DNA復性研究發現，漫游球菌是乳酸菌的一個獨立株系。目前對漫游球菌的研究較少，對其是否具有傳染性和致病性未有定論。近幾年有多篇報道研究證明一些河流漫游球菌在抑制魚類致病菌中起到了一定的作用[18-20]。本研究也分離到2 株漫游球菌（Vagococcus sp.wf-1和Vagococcus sp.wf-2）（表2），雖然，這兩株菌在鮮魚和腐敗白魚中并非優勢菌，但是它們可能在活魚中起到一定的抑制致病菌的作用，這需要做進一步研究。

本研究還分離得到了2 株芽孢桿菌：1 株泰瑞芽孢桿菌（Terribacillus sp. wf-1）和1株賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sp. wf-1）（表2）。泰瑞芽孢桿菌（Terribacillus）和賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus）同屬于芽孢桿菌科，都是革蘭氏陽性桿菌[21-22]。Lysinibacillus廣泛存在于水體、動物和植物中，對Lysinibacillus的研究多集中于其對減輕環境污染方面，如Lysinibacillus可以降解除草劑氟磺胺草醚、間甲苯酚和氮苯等物質[23-24]，還可以通過對鎳的吸附和對六價鉻還原減輕對環境的污染[25-26]。另據報道發現某些Lysinibacillus具有抑制食源性致病微生物的作用[22]。因此，對本研究獲得的兩株芽孢桿菌進行深入研究，發掘這2 株菌的潛在利用價值具有一定的環境和社會效益。

透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）在發酵菌株中高效表達能夠有效解決傳統發酵過程中由于氧傳遞而導致的產率低下和成本高的問題。本研究分離得到了1 株與透明顫菌（Vitreoscilla）相似度最高的細菌Vitreoscilla sp. wf-1，但是其16S rDNA序列與相似度最高的菌株Vitreoscilla stercoraria strain Gottingen 1488-6的相似度只有95.21%（表2），結合生化鑒定結果，最終確定Vitreoscilla sp. wf-1為透明顫菌。

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Isolation and Identification of Spoilage Organisms in Whitefish

XIA Xiudong1, LIU Xiaoli1, WANG Ying1, LI Ying1, DONG Mingsheng2, ZHOU Jianzhong1,*
(1. Institute of Agricultural Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The growth of spoilage organisms is the main factor causing the spoilage of aquatic products. Colony counting showed that the growth rate of spoilage microorganisms in whitefish was much faster at 25 ℃ than at 37 ℃, and therefore fish spoilage occurred more easily at the lower temperature. Through 16S rDNA sequence analysis, 21 strains isolated from putrid whitefish were identified as 11 different strains belonging to seven different genera: two strains of Morganella sp., three strains of Proteus sp., two strains of Vagococcus sp., one strain of Staphylococcu sp., one strain of Terribacillus sp., one strain of Lysinibacillus sp., one strain of Vitreoscilla sp.. In this study, the strains of Morganella sp. and Proteus sp. were the dominant spoilage bacteria and may be the SSO (specific spoilage organisms) in whitefish.

whitefish; spoilage organisms; isolation; 16S rDNA; identification

TS201.3

A

1002-6630（2015）21-0175-05

10.7506/spkx1002-6630-201521033

2015-06-04

江蘇省農業自主創新項目（CX（14）2118）

夏秀東（1985 —），男，博士，研究方向為水產品加工。E-mail：86084056@163.com

*通信作者：周劍忠（1965—），男，研究員，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：zjzluck@126.com