河豚魚16S rRNA基因部分DNA序列分析及應(yīng)用

陳文炳，翁國(guó)柱，陳融斌，繆婷玉，邵碧英，江樹勛，彭 娟

（1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，福建 福州 350001；2.莆田出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 莆田 351100；3.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021）

河豚魚16S rRNA基因部分DNA序列分析及應(yīng)用

陳文炳1，翁國(guó)柱2，陳融斌3，繆婷玉1，邵碧英1，江樹勛1，彭 娟1

（1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，福建 福州 350001；2.莆田出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 莆田 351100；3.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021）

應(yīng)用16S rRNA基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增通用引物，對(duì)3 屬13 種福建省搜集的河豚魚樣品與9 個(gè)未知物種的河豚魚樣品的16S rRNA基因序列中的部分片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增與脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）堿基序列測(cè)定，各物種序列長(zhǎng)度在611～614 bp之間。應(yīng)用DNAMAN V6軟件進(jìn)行樣品間DNA序列同源性比對(duì)分析，建立樣品間系統(tǒng)關(guān)系同源樹。供試13 個(gè)樣品被劃分為4 個(gè)類群組，群間的同源率為87%，群內(nèi)同源率為94%～100%。根據(jù)序列同源性分析結(jié)果，9 個(gè)未知種名的樣品被歸類到3 個(gè)類群組中，推測(cè)9 個(gè)未知種名的樣品為東方鲀屬或腹刺鲀屬。探討了16S rRNA基因部分DNA序列測(cè)試及同源性分析技術(shù)在河豚魚種屬鑒別中應(yīng)用的可能性。

河豚魚；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；16S rRNA基因；DNA測(cè)序；物種鑒定

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增技術(shù)獲得的特異性基因片段（DNA）堿基序列作為物種的特異性分子標(biāo)記，在食品中動(dòng)植物成分的鑒別方面已得到廣泛應(yīng)用[1-3]，在食品中魚類物種成分的鑒別也有不少研究與應(yīng)用[4-5]。隨著基因條形碼技術(shù)的發(fā)展，作為基因條形碼主要DNA序列的線粒體16S rRNA與細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ（COⅠ）的基因序列分析越來越多地被應(yīng)用于水產(chǎn)品的物種鑒別[6-10]。在河豚魚物種鑒定研究領(lǐng)域，陳超等[11]應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（random amplification of polymorphic DNA，RAPD）標(biāo)記對(duì)東方鲀屬、紅鰭東方鲀、假睛東方鲀、暗紋東方鲀和從日本引進(jìn)的紅鰭東方鲀4 種河豚魚進(jìn)行遺傳標(biāo)記鑒別與聚類分析研究。邵愛華等[12-16]對(duì)暗紋東方鲀（Takifugu fasciatus）進(jìn)行細(xì)胞色素b（Cytochrome b，Cyt b ）基因（Cyt b）及其側(cè)翼tRNA基因、線粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（COⅠ、COⅡ、COⅢ）3 種亞基、16S rRNA基因進(jìn)行了克隆與序列分析等一系列研究。但這些研究都只局限于東方鲀屬內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化并建立了河豚魚成分的PCR檢測(cè)方法、對(duì)3 個(gè)屬8 個(gè)物種的河豚魚成分進(jìn)行PCR方法檢測(cè)限與檢出率的實(shí)驗(yàn)[17]，還對(duì)3 屬9 種河豚魚的Cyt b基因部分序列進(jìn)行測(cè)定[18]，通過序列同源性分析，探討樣品間的同源性關(guān)系，并對(duì)應(yīng)用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和芯片生物分析系統(tǒng)、鑒別河豚魚品種[19]與限制性內(nèi)切酶、確證河豚魚成分PCR檢測(cè)結(jié)果等進(jìn)行了探討[20]。

本實(shí)驗(yàn)在13 個(gè)已知物種名稱的河豚魚的線粒體16S rRNA基因的部分DNA的PCR產(chǎn)物測(cè)序基礎(chǔ)上，進(jìn)行DNA序列同源性比對(duì)分析、建立樣品間的系統(tǒng)關(guān)系樹、并將9 個(gè)未知種名的河豚魚樣品16S rRNA基因的部分DNA的序列與13 個(gè)已知物種名稱的樣品進(jìn)行同源性比對(duì)分析、推測(cè)其種屬劃分，為16S rRNA基因的部分DNA序列測(cè)試及同源性分析技術(shù)在河豚魚物種鑒別中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，也為基因條形碼技術(shù)在河豚魚物種成分鑒定中的應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

13 個(gè)已知物種名稱的河豚魚樣品來自福建省集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院近海捕撈與廈門、莆田等水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)；未知物種名稱的5 個(gè)河豚魚干樣品來自福建福州沿海，4 個(gè)新鮮個(gè)體來自海南省海口市（表1）。

表1 13個(gè)已知種名與9 個(gè)未知種名的河豚魚供試樣品Table 1 The samples from 13 species and 9 unknown species of puffer fish tested in this study

1.2 試劑與儀器

十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB） 上海博亞生物技術(shù)有限公司；2×Taq PCR Master Mix、蛋白酶K、DNA MarkerⅠ 天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖 英國(guó)Oxoid公司；16S rRNA基因PCR擴(kuò)增通用引物[21]序列：正向L2510-16S：5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’，反向H3059-16S：5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

Ultrospec 1100 pro核酸蛋白分析儀 瑞典Amersham公司；T-Gradient梯度PCR儀 德國(guó)Biometra公司；Power Pac 1000電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；GL212 PRO凝膠成像儀 美國(guó)Carestream公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增

用CTAB裂解DNA提取方法[17]，以個(gè)體為測(cè)試樣品進(jìn)行DNA提取、PCR產(chǎn)物電泳。PCR擴(kuò)增體系為20 μL體系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），DNA模板量2 μL（200 ng/μL），雙蒸水（ddH2O）6 μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，反應(yīng)循環(huán)35 次；最后72 ℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后浸于0.2% EB溶液中染色45 min，用清水漂洗，最后置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，并拍照保存。

1.3.2 DNA堿基序列測(cè)定

用通用引物對(duì)所有收集到的共13 個(gè)河豚魚種與9 個(gè)未知名的河豚魚干樣品（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行克隆、測(cè)序，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，選用最有代表性的序列。得到的結(jié)果用DNAMAN V6進(jìn)行整理分析，以.seq格式輸出。

1.3.3 序列比對(duì)與同源性分析

本研究利用DNAMAN V6對(duì)各個(gè)樣品所測(cè)序列進(jìn)行堿基序列比對(duì)與同源性分析，比對(duì)結(jié)果以MASED Document/DNAMAN1格式輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 部分河豚魚的16S rRNA基因PCR擴(kuò)增

從13 種河豚樣品與9 個(gè)未知學(xué)名的河豚魚干樣品中提取的DNA，進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，部分樣品結(jié)果如圖1。結(jié)果表明供試22 個(gè)樣品的DNA PCR擴(kuò)增是成功的，PCR產(chǎn)物用于序列測(cè)定。

圖1 部分河豚魚的16S rRNA基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of 16S rRNA gene in puffer fish

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與序列比對(duì)

2.2.1 各樣品序列的堿基基本信息

提供各樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3 個(gè)重復(fù)，經(jīng)過克隆、測(cè)序，根據(jù)兩端引物序列，進(jìn)行整理，各樣品測(cè)序結(jié)果如有差異，則選取有代表性的序列，用于結(jié)果分析，并向美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（The National Center for Biotechnology Information，NCBI）基因銀行（GenBank）提交。13 個(gè)已知物種名稱的樣品序列的基本信息統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果與GenBank登錄號(hào)見表2。

表2 PCR產(chǎn)物堿基序列的基本信息Table 2 Basic information about base sequences of PCR products

從表2可以看出，不同物種的河豚魚的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在611～614 bp之間，從A、C、G、T 4 種堿基的含量來看，A含量最高，在29.3%～30.5%， 其次是C與T，含量分別在23.5%～24.8%與22.9%～24.8%，G含量較低，在21.7%～23.4%之間。從各樣品4 個(gè)堿基含量差異來看，黃鰭東方鲀、暗鰭腹刺鲀、月腹刺鲀、雙斑東方鲀、菊黃東方鲀、鉛點(diǎn)東方鲀6 個(gè)種的G含量最低，均在22%以下，與各自A的含量相差8%以上。黃鰭東方鲀、紅鰭腹刺鲀、雙斑東方鲀、菊黃東方鲀、鉛點(diǎn)東方鲀5 個(gè)種所含堿基數(shù)均為614 個(gè)； 暗紋東方鲀、棕斑腹刺鲀、橫紋東方鲀3 個(gè)種的堿基數(shù)最少，為611 個(gè)；暗鰭腹刺鲀堿基數(shù)為613 個(gè)；黑腮兔頭鲀、兔頭鲀、月腹刺鲀、蟲紋東方鲀堿基數(shù)均為612 個(gè)。

2.2.2 已知物種樣品DNA測(cè)序與序列比對(duì)分析

已知種名的河豚魚樣品PCR產(chǎn)物的DNA測(cè)序以.seq格式輸出，再以DNAMAN V6軟件進(jìn)行比對(duì)，分析結(jié)果以MASED Document/DNAMAN1格式輸出（圖略）。從結(jié)果可知：4、6、10～12號(hào)（樣品序號(hào)與表1同）等5 個(gè)樣品的第39號(hào)堿基缺失；3、5、9號(hào)等3 個(gè)樣品的第296號(hào)堿基缺失；1～3、5、7～9、13號(hào)等8 個(gè)樣品的第388號(hào)與438～439號(hào)堿基均缺失；除了3 個(gè)片段（位置處在約第30～40號(hào)、第272～294號(hào)、第423～39號(hào)堿基）有明顯的變異外，其余差異多是個(gè)別堿基的置換，可見供試河豚魚物種間的分化主要源于堿基缺失、插入、置換等遺傳變異。

圖2 13個(gè)已知種樣品的PCR產(chǎn)物序列同源樹Fig.2 Phylogenetic tree based on sequence homology among 13 species known samples

基于DNA序列分析結(jié)果，建立的PCR產(chǎn)物序列同源樹（圖2）表明，13 個(gè)已知物種的樣品PCR擴(kuò)增片段的序列整體同源率為87%（樣品號(hào)與表1同），表明盡管13 個(gè)種樣品的來源于四齒鲀科（Tetraodontidae）的兔頭鲀屬（Lagocephalus）、腹刺鲀屬（Gastrophysus）與東方鲀屬（Takifugu）3 個(gè)不同的屬，其保守的16S rRNA基因序列同源性仍然較高，13 個(gè)樣品可劃分為4組（圖2），其中Ⅰ組含1號(hào)（黑腮兔頭魨）、2號(hào)（兔頭魨）、13號(hào)（蟲紋東方鲀）3 個(gè)樣品，堿基數(shù)均為612 個(gè)；Ⅱ組含3號(hào)（暗紋東方鲀）、5號(hào)（棕斑腹刺鲀）、9號(hào)（橫紋東方鲀）3個(gè)樣品，堿基數(shù)均為611 個(gè)；Ⅲ組含7號(hào)（暗鰭腹刺鲀）與8號(hào)樣品（月腹刺鲀）2 個(gè)樣品，堿基數(shù)為613與612 個(gè)；Ⅳ組含4號(hào)（黃鰭東方鲀）、6號(hào)（紅鰭東方鲀）、10號(hào)（雙斑東方鲀）、11號(hào)（菊黃東方鲀）、12號(hào)（鉛點(diǎn)東方鲀）5 個(gè)樣品，堿基數(shù)均為614 個(gè)。可見DNA序列的堿基個(gè)數(shù)與物種同源性有一定的關(guān)系。前3組間同源性為94%，各組內(nèi)同源率在98%～100%。Ⅳ組內(nèi)5 個(gè)樣品之間的同源率為99%～100%，Ⅳ組與其余3組間的同源率為87%。

2.3 應(yīng)用序列同源性分析推測(cè)未知樣品物種歸屬

圖3 22個(gè)樣品的序列同源樹Fig.3 Phylogenetic tree based on sequence homology among 22 samples

9 個(gè)未知種名的樣品（序列未出示）與13 個(gè)已知種樣品序列經(jīng)DNAMAN V6軟件的同源性比對(duì)分析，獲得同源性矩陣（略）與同源樹（圖3）。聚類結(jié)果表明：與圖2相同，22 個(gè)樣品序列可劃分為4組，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間同源率為94%，它們與Ⅳ組之間的同源率為86%。第Ⅰ組與圖3相同，海南未知樣品HNW2歸到Ⅱ組，因與7號(hào)樣品（暗鰭腹刺魨）同源率為99%，與8號(hào)樣品（月腹刺魨）同源率為100%，推測(cè)該未知樣品可能是腹刺魨屬河豚魚；有3 個(gè)福建未知種名河豚魚樣品（FJW2、FJW3、FJW5）和3個(gè)海南未知種名河豚魚樣品（HNW1、HNW3、HNW4）歸到Ⅲ組，因?yàn)榕c3號(hào)暗鰭東方鲀、5號(hào)棕斑腹刺魨、9號(hào)橫紋東方鲀的同源率在97%以上，故推測(cè)該6 個(gè)樣品可能是東方鲀屬或腹刺鲀屬；福建未知種名樣品FJW1與FJW4歸到第Ⅳ組，與4號(hào)（黃鰭東方鲀）、6號(hào)（紅鰭東方鲀）、10號(hào)（雙斑東方鲀）、11號(hào)（菊黃東方鲀）、12號(hào)（鉛點(diǎn)東方鲀）5 個(gè)樣品的同源率為98%以上，推測(cè)該2種樣品為東方鲀屬河豚魚。

3 結(jié)論與討論

運(yùn)用生物信息學(xué)專業(yè)軟件DNAMAN V6，比對(duì)分析了河豚魚16S rRNA部分片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列。13 個(gè)已知物種名稱的樣品序列經(jīng)DNAMAN V6軟件的同源性分析，獲得同源樹，把13 個(gè)樣品序列劃分為4 組，各組內(nèi)樣品間同源率均為94%～100%，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間的同源率為94%，它們與Ⅳ組間同源率為87%。圖2表明，1號(hào)黑腮兔頭魨與2號(hào)兔頭魨、7號(hào)暗鰭腹刺鲀與8號(hào)月腹刺鲀分別歸為一類，與形態(tài)學(xué)分類吻合。應(yīng)用同源性分析推斷9 個(gè)未知種屬名稱的河豚魚樣品可能所屬的分類單位（屬）。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，河豚魚物種間的分化主要源于堿基缺失、插入、置換等遺傳變異結(jié)果。但是，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于序列同源性分析的類群劃分與形態(tài)學(xué)分類不完全吻合，原因可能是形態(tài)學(xué)分類存在瑕疵，比如同種異名或同名異種的情況，這些情況在動(dòng)植物系統(tǒng)分類學(xué)領(lǐng)域時(shí)有發(fā)生；也可能是16S rRNA序列趨向保守，一定種群內(nèi)遺傳變異較小，加上所獲得基因信息有限，因而還無法具體鑒定到河豚魚的物種。理論上，動(dòng)植物分類標(biāo)記信息包括形態(tài)學(xué)與分子遺傳學(xué)標(biāo)記的信息量越大，其分類定位越接近實(shí)際情況。因此，盡管16S rRNA序列趨向保守，一定種群內(nèi)遺傳變異可能較小，但作為重要的分子標(biāo)記與遺傳信息，對(duì)河豚魚等水生生物的親緣關(guān)系與分類的研究探討，無疑有積極的作用[11,16,18]。當(dāng)然，為了進(jìn)一步判別到具體的物種，還須通過線粒體的其他基因如Cyt b、COⅠ和核糖體基因18S/28S rDNA等片段的測(cè)序，建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用多種基因序列組合互相彌補(bǔ)缺陷，達(dá)到精準(zhǔn)鑒別河豚魚物種成分的目的。

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Partial DNA Sequence Analysis of 16S rRNA Gene in Puffer Fish

CHEN Wenbing1, WENG Guozhu2, CHEN Rongbin3, MIAO Tingyu1, SHAO Biying1, JIANG Shuxun1, PENG Juan1
(1. Inspection and Quarantine Technology Center, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China; 2. Putian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Putian 351100, China; 3. Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China)

Partial fragments of the 16S rRNA gene of puffer fish from 13 species belonging to 3 genus collected from Fujian province and 9 samples from unknown species were amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the universal 16S rRNA gene primers. The PCR products were sequenced, and the length of the obtained DNA fragments were 611-614 bp in all samples. The homology of DNA sequences among samples was analyzed with the DNAMAN V6 software, and the phylogenetic tree among samples was established. Thirteen samples were divided into 4 groups, with a homology of 87% among groups and 94%-100% between any two samples within the same group. Nine samples of unknown puffer fish species were classed into 3 groups which belonged to the Gastrophysus or Takifugu genus. The results obtained in this study can provide references for the application of 16S rRNA gene sequencing and homological analysis to identify puffer fish at genus and species levels.

puffer fish; polymerase chain reaction; 16S rRNA gene; DNA sequencing; species identification

S917.4；Q78

A

1002-6630（2015）21-0140-05

10.7506/spkx1002-6630-201521027

2015-06-30

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013IK149）

陳文炳（1962—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品、食品分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。E-mail：621213wbc@163.com