焦亞硫酸鈉對酵母細胞的毒性作用

喬瑞芳，儀 民，儀慧蘭,*

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.密蘇里大學哥倫比亞分校統計系，哥倫比亞 MO 65211，美國）

焦亞硫酸鈉對酵母細胞的毒性作用

喬瑞芳1，儀 民2,*，儀慧蘭1,*

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.密蘇里大學哥倫比亞分校統計系，哥倫比亞 MO 65211，美國）

為探討焦亞硫酸鈉的保鮮防腐機制，采用毒理學方法研究保鮮劑對酵母細胞的毒性效應。結果表明：在100～1 000 μmol/L濃度范圍內，焦亞硫酸鈉可抑制酵母細胞生長分裂，誘發細胞死亡；隨著焦亞硫酸鈉濃度升高和作用時間延長，其對酵母細胞的毒性效應也逐漸增強。經100 μmol/L焦亞硫酸鈉作用2 h后，酵母細胞生長曲線與對照組產生差異；300 μmol/L焦亞硫酸鈉處理6 h后，酵母細胞死亡率顯著高于對照組，用抗壞血酸或LaCl3預處理可阻止焦亞硫酸鈉誘發的酵母細胞死亡，表明焦亞硫酸鈉通過誘導酵母細胞內活性氧和Ca2+水平升高來引發細胞死亡。研究還發現，相同濃度的焦亞硫酸鈉作用后，pH 4.0組酵母細胞的死亡率明顯高于pH 7.0組，即酸性環境能增強焦亞硫酸鈉對酵母細胞的毒性作用，有助于保鮮劑的抑菌防腐。

焦亞硫酸鈉；保鮮劑；酵母細胞；生長抑制；細胞死亡

葡萄（Vitis vinifera L.）是世界上第四大水果，在我國銷量很大，但由于鮮食葡萄在貯藏和運輸期間易腐爛，需要采取一定的保鮮措施。二氧化硫（SO2，由焦亞硫酸鈉釋放）是傳統的葡萄保鮮劑，也是目前為止葡萄果實貯藏期間最為有效的防腐保鮮劑[1-2]，SO2能抑制病原菌生長、延緩果實衰老，但SO2貯藏會影響果實品質，導致果實中SO2殘留量增加，對果實的食用安全性造成影響[3-4]。為了尋求更為安全的保鮮措施，研究人員采用物理手段（紫外線輻照或氣調方式）、化學藥物（H2O2、氯化鈣等）或生物材料（植物油、幾丁質酶、殼聚糖等）對葡萄果實保鮮，取得了一定效果，但保鮮作用均不如SO2[1,5-7]。因此，研究控制SO2適宜的濃度成為葡萄保鮮領域的難題[8]。

SO2易溶于水生成和（SO2水合物）[9-10]，因此，在葡萄貯藏箱內焦亞硫酸鈉（Na2S2O5）釋放SO2，箱內的高濕度（相對濕度約95%）環境使SO2溶于水分子中形成SO2水合物，SO2水合物作用于果穗及其攜帶的酵母菌、病原菌等，從而發揮防腐保鮮作用。SO2水合物滯留在果穗表面或進入果實中，果穗表面的SO2水合物能直接作用于微生物，進入果實內部的和在植物細胞內的代謝轉化可能激活細胞氧化應激防御系統[1,9]，提高自身防御能力。但目前為止，SO2的防腐保鮮機制尚不清楚，其通過何種機制影響葡萄果實衰老和病原菌致病性還有待研究。

葡萄果實表面攜帶有大量酵母菌，對酵母細胞具有抑制效應的化合物具有對葡萄果實保鮮的作用[11]。而酵母細胞具有生長周期短、易培養的特點，已成為研究真核生物細胞學機制的模式生物，環境理化因素如紫外線、有害金屬離子As3+和Al3+等均可誘導酵母細胞死亡[12-14]。因此，本實驗以酵母菌為材料，研究特定條件下SO2對酵母細胞的毒性效應，以揭示SO2保鮮防腐的作用機制。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），實驗室自行保存，挑取單菌落用YPD培養基活化。

焦亞硫酸鈉 美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌生長速率測定

取活化酵母菌液，接入新培養基（葡萄糖10 g、硫酸銨3 g、磷酸二氫鉀3 g、酵母提取物1 g、硫酸鎂25 mg、無水氯化鈣20 mg，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液調pH值至4.0）中，250 r/min、30 ℃培養，待酵母細胞濃度達到4×106個/mL時加入一定量的焦亞硫酸鈉繼續振蕩培養，間隔一定時間取發酵液，用分光光度計在600 nm波長處檢測光密度（OD600nm）值，繪制酵母菌生長曲線。

1.2.2 酵母細胞活性檢測

以pH 4.0或pH 7.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制特定濃度的焦亞硫酸鈉溶液。取活化酵母細胞接入YPD培養基中培養，收集對數生長期細胞，用pH 7.0磷酸鹽緩沖液洗滌后加入一定濃度的焦亞硫酸鈉溶液制備細胞懸液使酵母細胞濃度為106個/mL，于30 ℃、200 r/min孵育6 h。干預組采用抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）或LaCl3預處理10 min后，再與焦亞硫酸鈉同時作用6 h。檢測時間效應時，在藥物作用期間，每間隔一定時間取細胞檢測細胞活性。

藥物作用結束后，采用美藍染色法檢測細胞活性，利用活細胞新陳代謝旺盛，能將進入細胞內的美藍還原為無色，而死細胞或衰老細胞因不能將美藍有效還原而呈現藍色的特點，鑒定細胞活力。藥物處理后，取適量酵母細胞用美藍染液染色，于光學顯微鏡下觀察并統計著色細胞和總細胞數目，按照下式計算細胞死亡率。每個處理至少重復3 次，每次重復至少觀察1 000 個細胞。

1.3 數據分析

用SPSS v16.0對所得結果進行方差分析，采用Duncan’s多重比較法比較分析不同處理組之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 焦亞硫酸鈉對酵母細胞生長的影響

檢測葡萄常規貯藏過程中（0 ℃低溫與SO2保鮮劑結合）貯藏箱內葡萄果粒表面液滴的pH值發現，果實表面pH值在3.0～4.2之間，雖然不同葡萄品種間pH值存在一定差異，但使用SO2保鮮劑的實驗組果實表面pH值均低于無SO2的對照組，貯藏40 d時，SO2處理組玫瑰香葡萄果粒表面pH值約為3.5，對照組pH值為4.0。以此為據，本實驗采用pH 4.0的培養基培養酵母細胞，發現添加焦亞硫酸鈉的4 組培養液中酵母菌OD600nm值均低于同期無焦亞硫酸鈉處理的對照組（圖1），焦亞硫酸鈉濃度越高，其與對照組間的差異越大；隨著培養時間的延長，各焦亞硫酸鈉處理組與對照組OD600nm值的差異增大。1 000 μmol/L焦亞硫酸鈉處理組的酵母細胞生長緩慢，在接種8 h后OD600nm提高了0.041 0，而同期對照組OD600nm提高了0.903 0。由此可見，一定濃度的焦亞硫酸鈉能夠抑制酵母細胞的生長分裂，且抑制效應具有濃度和時間依賴性。

圖1 焦亞硫酸鈉對酵母細胞生長的影響Fig.1 Effect of sodium metabisulfite on yeast cell growth

2.2 焦亞硫酸鈉對酵母細胞活性的影響

為證實焦亞硫酸鈉對酵母細胞的毒性作用，采用美藍染色法對細胞活性進行觀測，結果如圖2所示。在pH 4.0時，4 個不同濃度焦亞硫酸鈉作用6 h后，酵母細胞存活率均低于對照組，部分酵母細胞死亡，隨著焦亞硫酸鈉濃度的升高，酵母細胞相對存活率降低，相應地，細胞死亡率增大，焦亞硫酸鈉對酵母細胞的毒性效應表現一定的劑量依賴性。焦亞硫酸鈉低濃度長期作用或高濃度短期作用均表現出明顯的細胞毒性，可致酵母細胞死亡。

圖2 焦亞硫酸鈉對酵母細胞的致死效應Fig.2 Lethal effect of sodium metabisulfite on yeast cells

不同pH值條件下酵母細胞活性檢測結果如圖3所示，當介質pH值由中性變為酸性時，焦亞硫酸鈉的細胞毒性效應明顯增強：濃度300 μmol/L的焦亞硫酸鈉在酸性（pH 4.0）條件下對酵母細胞具有致死效應，而中性（pH 7.0）條件下對酵母細胞不具有明顯致死效應；在pH 7.0條件下，焦亞硫酸鈉濃度達到600 μmol/L以上時，才對酵母菌產生細胞毒性。由此可見，酸性條件有助于焦亞硫酸鈉發揮對酵母細胞的毒性作用。

圖3 pH值影響焦亞硫酸鈉對酵母細胞的毒性Fig.3 Effect of pH on the toxicity of sodium metabisulfite to yeast cells

2.3 AsA和LaCl3對焦亞硫酸鈉毒性的緩解作用

用外源抗氧化劑AsA或質膜Ca2+通道特異性抑制劑LaCl3與600 μmol/L焦亞硫酸鈉同時作用酵母細胞6 h后，細胞存活率明顯升高（圖4），即用AsA降低胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平后可緩解焦亞硫酸鈉對酵母細胞的毒性作用，而LaCl3阻止胞外Ca2+內流，同樣可以抑制焦亞硫酸鈉的細胞毒性，該結果說明保鮮劑SO2對酵母細胞的毒性與其誘導細胞內ROS和Ca2+水平升高有關。

圖4 外源AsA和LaCl3對焦亞硫酸鈉處理酵母細胞毒性的影響Fig.4 Effect of ascorbic acid and LaCl3on the toxicity of sodium metabisulfite to yeast cells

3 討 論

焦亞硫酸鈉（貯藏過程中釋放出SO2）是常用的保鮮防腐劑，在水果貯藏保鮮、果脯加工、紅酒釀制等過程中被廣泛使用。研究表明，較高濃度的SO2對多種植物細胞具有毒性，可引發遺傳損傷、細胞死亡等[15-16]。本實驗采用葡萄果實貯藏保鮮劑焦亞硫酸鈉釋放SO2的原理，研究了濃度100～1 000 μmol/L的焦亞硫酸鈉對酵母細胞的毒性效應，發現一定濃度的焦亞硫酸鈉可抑制酵母細胞生長分裂，還能引起細胞死亡，說明SO2對微生物細胞具有毒性；隨著暴露時間的延長，酵母細胞相對存活率下降，死亡細胞數目增加，表現出了一定的時間依賴性。為了證實保鮮過程中焦亞硫酸鈉對果實表面微生物的毒性作用，實驗同時采用菌落平板計數法檢測了焦亞硫酸鈉處理后酵母細胞的活性，取得了一致的結果；在前期對購自中國科學院標注為“模式生物”的釀酒酵母菌株的測試中發現，50 μmol/L焦亞硫酸鈉作用12 h后該酵母菌株的細胞死亡率達到85%，死亡率高于本實驗所用酵母菌株，說明不同酵母菌株對焦亞硫酸鈉的敏感性存在差異。因此，在貯藏期間焦亞硫酸鈉可能對葡萄果實表面的不同酵母菌株表現出不同程度的毒性，并對其他病原菌產生毒性，從而發揮其保鮮防腐作用。

培養介質中加入焦亞硫酸鈉后，酵母菌的OD600nm值出現差異的原因可能有兩方面：一是焦亞硫酸鈉抑制酵母細胞生長和分裂，部分細胞可能因胞內DNA合成受到抑制而脫離細胞增殖周期轉入休眠狀態，在顯微鏡下也觀察到了焦亞硫酸鈉處理組的酵母細胞出芽生殖被抑制（圖2b）；二是焦亞硫酸鈉長期作用導致部分酵母細胞活性降低或死亡，使具有增殖能力的酵母細胞數量減少，子細胞產生速率下降。上述兩者共同導致焦亞硫酸鈉處理組酵母細胞生長緩慢，細胞總數量減少，相應的OD600nm值降低。

用H2O2、紫外輻照處理雖然也能誘發葡萄果實細胞抗氧化防御應答，但其保鮮效果不及SO2[1]，原因可能還與SO2水合過程及在植物細胞內的代謝和轉化過程有關。進入果實內部的和可經過植物細胞內的硫代謝途徑得以轉化，其中氧化途徑可將轉化為，還原途徑生成半胱氨酸，半胱氨酸是細胞內其他含硫氨基酸、肽和蛋白質的前體，SO2處理后植物細胞內硫代謝途徑增強，細胞內、及還原性含硫產物水平提高[1,10,17]。細胞內含硫產物如半胱氨酸、谷胱甘肽、蛋白質巰基及谷胱甘肽硫轉移酶等參與細胞防御應答和代謝解毒過程，在生物和非生物脅迫中發揮作用[18-19]，因此，SO2處理后植物細胞內含硫抗氧化物水平的升高可能在果實保鮮過程中參與調控了細胞對環境的適應性，并增強了其抗逆性。但細胞代謝的同時產生ROS，如超氧陰離子自由基（·）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）等[1,9-10]，使胞內ROS水平升高。脅迫引發細胞內ROS水平升高具有雙重作用，一是作為毒性分子攻擊生物大分子引發細胞損傷，二是作為信號分子參與多種細胞生理過程[20-22]；SO2脅迫組擬南芥和蠶豆葉細胞中ROS水平升高同樣具有氧化損傷和信號分子雙重功效，其效應與SO2濃度及ROS水平相關[23-24]。因此，SO2處理組葡萄果實內部高水平的ROS不僅能激活細胞抗氧化防御應答，發揮保鮮作用[1]，還可能對周圍的酵母菌和其他微生物細胞產生氧化損傷，導致微生物生長抑制和細胞死亡，其效應取決于SO2濃度和果實組織中ROS的水平。本實驗加入外源ROS清除劑AsA，降低酵母細胞內ROS水平后，細胞死亡率顯著下降，說明SO2處理誘導酵母細胞ROS水平升高是酵母細胞死亡的一個誘因，該結果也為葡萄果實內ROS水平升高可能參與抑菌作用提供了間接證據。

本課題組前期研究發現，SO2可誘導蠶豆、擬南芥細胞凋亡，并伴隨著細胞內Ca2+濃度的升高，高水平的Ca2+可介導細胞死亡，其中細胞外Ca2+內流是細胞內Ca2+水平升高的一個誘因[16]。本研究發現，在SO2處理過程中加入質膜Ca2+通道特異性抑制劑LaCl3后，酵母細胞死亡率降低，表明SO2處理組酵母細胞死亡與細胞內Ca2+水平升高有關。有研究發現，ROS可以激活質膜Ca2+通道，介導植物細胞外Ca2+內流[25]；在酵母細胞中可能也存在類似的機制，SO2脅迫引發的ROS合成增加可能會影響質膜Ca2+通道的通透性，引發細胞外Ca2+內流，促使細胞內Ca2+水平升高，繼而介導細胞死亡。此外，SO2處理組酵母細胞內高水平的ROS也可能直接攻擊生物大分子DNA、蛋白質、膜脂等，造成細胞氧化損傷，引發細胞死亡。

4 結 論

葡萄保鮮劑焦亞硫酸鈉可抑制酵母細胞生長分裂，高劑量短期作用或低劑量長期作用均能誘導酵母細胞死亡，因此貯藏初期采用較高濃度SO2抑制微生物生長繁殖，之后以低濃度SO2長期作用抑制微生物活性，可有效控制果實外部微生物，發揮防腐保鮮作用。焦亞硫酸鈉的保鮮作用與其降低果實表面pH值有關，酸性pH值條件下SO2對酵母細胞的毒性作用明顯增強。

[1] GIRAUD E, IVANOVA A, GORDON C S, et al. Sulphur dioxide evokes a large scale reprogramming of the grape berry transcriptome associated with oxidative signalling and biotic defence responses[J]. Plant Cell and Environment, 2011, 35: 405-417.

[2] KOKKALOS T I. Posthavest decay control of grapes by using sodium metabisulfite in cartons enclosed in plastic bags[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1986, 37: 149-151.

[3] 武建明, 鐘梅, 吳斌, 等. 新疆鮮食葡萄保鮮過程中SO2殘留行為的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(3): 486-489.

[4] 李志文, 張平, 黃艷鳳, 等. 貯藏保鮮中SO2傷害對紅提葡萄香氣組分的影響[J]. 西北植物學報, 2011, 31(2): 385-392.

[5] D’HALLEWIN G, LADU G, PANI G, et al. Postharvest physiopathological disorders in table grapes as affected by UV-C light[J]. Communications in Agricultural and Applied Biological Sciences, 2012, 77(4): 515-525.

[6] PETIT A N, BAILLIEUL F, VAILLANT-GAVEAU N, et al. Low responsiveness of grapevine flowers and berries at fruit set to UV-C irradiation[J]. Journal of Experimental Botany, 2009, 60(4): 1155-1162.

[7] SHIN M H, KIM J H, CHOI H W, et al. Effect of thymol and linalool fumigation on postharvest diseases of table grapes[J]. Mycobiology, 2014, 42(3): 262-268.

[8] 趙猛, 王春生, 李建華, 等. SO2兩段釋放處理對紅提葡萄貯藏品質的影響[J]. 果樹學報, 2011, 28(4): 685-688.

[9] LI Lihong, YI Huilan. Differential expression of Arabidopsis defenserelated genes in response to sulfur dioxide[J]. Chemosphere, 2012, 87: 718-724.

[10] KOPRIVA S. Regulation of sulfate assimilation in Arabidopsis and beyond[J]. Annals of Botany, 2006, 97(4): 479-495.

[11] CRISTINA C, ANNALISA L, AMALIA C, et al. In vitro and in vivo application of active compounds with anti-yeast activity to improve the shelf life of ready-to-eat table grape[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2013, 29(6): 1075-1084.

[12] WU Lihua, YI Huilan, ZHANG Hufang. Reactive oxygen species and Ca2+are involved in sodium arsenite-induced cell killing in yeast cells[J]. FEMS Microbiology Letter, 2013, 343: 57-63.

[13] del CARRATORE R, DELLA CROCE C, SIMILI M, et al. Cell cycle and morphological alterations as indicative of apoptosis promoted by UV irradiation in S. cerevisiae[J]. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2002, 513: 183-191.

[14] ZHENG Ke, PAN Jianwei, YE Lan, et al. Programmed cell deathinvolved aluminum toxicity in yeast alleviated by antiapoptotic members with decreased calcium signals[J]. Plant Physiology, 2007, 143: 38-49.

[15] 儀慧蘭, 姜林. SO2水合物誘發蠶豆(Vicia faba)根尖細胞染色體畸變效應[J]. 生態學報, 2007, 27(6): 2318-2324.

[16] YI Huilan, YIN Jingjing, LIU Xin, et al. Sulfur dioxide induced programmed cell death in Vicia guard cells[J]. Ecotoxicology and Environment Safety, 2012, 78: 281-286.

[17] 李利紅, 儀慧蘭, 武冬梅. 二氧化硫脅迫誘發擬南芥植株含硫抗氧化物水平提高[J]. 應用與環境生物學報, 2010, 16(5): 613-616.

[18] NOCTOR G, MHAMDI A, CHAOUCH S, et al. Glutathione in plants: an integrated overview[J]. Plant Cell and Environment, 2012, 35: 454-484.

[19] H?LLER K, KIRáLY L, KüNSTLER A, et al. Enhanced glutathione metabolism is correlated with sulfur-induced resistance in tobacco mosaic virus: infected genetically susceptible Nicotiana tabacum plants[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2010, 23(11): 1448-1459.

[20] BREUSEGEM F V, DAT J F. Reactive oxygen species in plant cell death[J]. Plant Physiology, 2006, 141: 384-390.

[21] FOYER C, NOCTOR G. Oxidant and antioxidant signalling in plants: a re-evaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context[J]. Plant, Cell and Environment, 2005, 28: 1056-1071.

[22] SUZUKI N, KOUSSEVITZKY S, MITTLER R, et al. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress[J]. Plant, Cell and Environment, 2012, 35: 259-270.

[23] YI Huilan, LIU Xin, YI Min. Dual role of hydrogen peroxide in Arabidopsis guard cells in response to sulfur dioxide[J/OL]. Advances in Toxicology, 2014. http://dx.doi.org/10.1155/2014/407368.

[24] ZHAO Jun, YI Huilan. Genome-wide transcriptome analysis of Arabidopsis response to sulfur dioxide fumigation[J]. Molecular Genetics and Genomics, 2014, 289: 989-999.

[25] PEI Ziming, MURATA Y, BENNING G, et al. Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signaling in guard cells[J]. Nature, 2000, 406: 731-734.

Toxicity of Sodium Metabisulfite on Yeast Saccharomyces cerevisiae

QIAO Ruifang1, YI Min2,*, YI Huilan1,*
(1. College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Department of Statistics, University of Missouri-Columbia, Columbia MO 65211, USA)

Sodium metabisulfite is commonly used as a food preservative and antioxidant for dried foods, fruit concentrate juices and fresh fruits. It is the most efficiently preservative for table grape since table grapes are subject to serious water loss and decay while making the long trip from the vine to tables around the world. Herein, the effects of sodium metabisulfite on cell viability were explored in the model eukaryote Saccharomyces cerevisiae. The growth curve of yeast cells was measured by optical density, and cell viability was examined based on methylene blue staining method. Randomly selected views on the tested yeast cells were monitored under a microscope to determine the number of dead cells and the total number of scored cells. The results indicated that sodium metabisulfite could inhibit yeast cell growth and division, and even cause cell death. The toxicity of sodium metabisulfite was increased with increasing concentration and prolonged duration. Either high concentration for a shorter-term exposure or low concentration for a long-term exposure showed significant toxic effects on yeast cells. Exposure to 100 to 1 000 μmol/L sodium metabisulfite for 6 h could cause significant cell death, and both antioxidant ascorbic acid and plasma membrane Ca2+channel inhibitor LaCl3blocked sodium metabisulfite-induced cell death. These results indicated that sodium metabisulfite could cause yeast cell death via reactive oxygen species (ROS) production and Ca2+influx. However, the death rate increased in acidic environment. The cell death rate in pH 4.0 treatment group was higher than that in pH 7.0 treatment group, demonstrating the enhanced sulfur dioxide (SO2) toxicity in acidic medium. It was found that the pH of waterdrop on the surface of SO2-fumigated table grapes was around 3.5 to 4.0, which was lower than the control without SO2fumigation, suggesting that acid environment caused by SO2fumigation is a way to prevent infection and prolong the shelf life of table grapes.

sodium metabisulfite; preservative; yeast cell; growth inhibition; cell death

Q945.6

A

1002-6630（2015）21-0010-05

10.7506/spkx1002-6630-201521003

2014-12-20

國家自然科學基金面上項目（30870454；30470318；31371868）；

2012年度高等學校博士學科點專項科研基金項目（20121401110007）

喬瑞芳（1985—），女，碩士，研究方向為環境生物學。E-mail：574150223@qq.com

*通信作者：儀民（1987—），男，博士，研究方向為環境生物學。E-mail：myfd2@mail.missouri.edu

儀慧蘭（1963—），女，教授，博士，研究方向為環境生物學。E-mail：yihl@sxu.edu.cn