黃牛毛蘚水提液對(duì)冬棗輪紋病致病菌抑制效應(yīng)的初步研究

劉俊華++張孝霖

摘 要：為了初步闡明苔蘚植物的抑菌效應(yīng)，以我國(guó)傳統(tǒng)藥用苔蘚植物黃牛毛蘚（Ditrichum pallidum）為試驗(yàn)材料，以冬棗輪紋病致病菌大莖點(diǎn)霉為受試菌株，采用菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)黃牛毛蘚配子體水粗提液進(jìn)行了抑菌作用的初步研究。結(jié)果表明：黃牛毛蘚水浸提液對(duì)大莖點(diǎn)霉有一定程度的抑制作用，且隨著黃牛毛蘚水浸提液濃度的增加，其抑菌效果愈加明顯，在較高濃度（>40mg/mL）條件下，抑菌率達(dá)50%以上。因此，黃牛毛蘚提取物在冬棗輪紋病的生物防治方面具有一定的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：黃牛毛蘚；抑菌作用；大莖點(diǎn)霉；苔蘚植物；冬棗

中圖分類號(hào) Q948.12 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）23-23-03

Antifungal Effect of Water Extracts from Ditrichum pallidum on Macrophoma kuwatsukai

Liu Junhua 1 et al.

（1Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta，Binzhou 256603，China）

Abstract：The antibacterial effect of bryophyte Ditrichum pallidum with its water extraction were studied，which distributed widely in Shandong province. The results indicated that Ditrichum pallidumhad restrain effects on Macrophoma kuwatsukai to a certain extent. And the bacteriostatic effect is more obvious along with the increasing of extraction concentration. At the concentration of 160mg/mL，its inhibition rate on Macrophoma kuwatsukai was more than 70%. As an import medicinal moss species，Ditrichum pallidumhad has certain development value in controlling harmful organism of‘Dongzao jujube.

Key words：Ditrichum pallidum；Antifungal effect；Macrophoma kuwatsukai；Bryophytes；‘Dongzao jujube

苔蘚植物種類多樣，對(duì)環(huán)境具有廣泛的適應(yīng)性[1-4]，能夠產(chǎn)生如萜類、黃酮類、脂肪酸等次生代謝產(chǎn)物以及一些生物活性物質(zhì)，是潛在的天然活性產(chǎn)物寶庫(kù)[3-5]。目前，已有多種苔蘚植物被證明有抑制微生物活性的作用[1，4，9-10]。目前，在苔蘚植物的應(yīng)用基礎(chǔ)性研究中，抑菌性作用研究?jī)H占了其中的極小一部分，而我國(guó)擁有豐富的苔蘚植物資源，但有關(guān)其抑菌作用的研究仍處于起步階段。前期研究表明，黃牛毛蘚對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、變形桿菌（Proteus vulgris）生長(zhǎng)具有一定的抑制作用[9]，但尚未見(jiàn)以植物病原菌為受試菌株的抑菌研究。為此，本試驗(yàn)以黃牛毛蘚作為植物材料，以冬棗輪紋病致病菌為受試菌株，利用其黃牛毛蘚配子體水提液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，初步闡明了黃牛毛蘚對(duì)冬棗輪紋病致病菌的抑制作用及表現(xiàn)出的濃度效應(yīng)，旨在為以黃牛毛蘚為代表的藥用苔蘚植物資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試樣品 黃牛毛蘚（Ditrichum pallid um（Hedw）Hamp.），于2009年春采自山東蒙山（海拔850m處）。

1.1.2 供試菌株 本研究所用供試菌株為大莖點(diǎn)霉，由濱州學(xué)院生物學(xué)試驗(yàn)教學(xué)中心提供。大莖點(diǎn)霉是冬棗輪紋病的病原菌[11-12]，該菌屬于半知菌亞門Deuteromycotina、腔孢綱Coelomycetes、球殼孢目Sphaeropsidales、球殼孢科Sphaeropsidaceae、大莖點(diǎn)菌屬M(fèi)acrophoma、輪紋大莖點(diǎn)菌Macrophoma kuwatsukaiihara。

1.1.3 培養(yǎng)基及成分 本研究采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1 000mL，pH為自然值。

1.2 研究方法

1.2.1 黃牛毛蘚水浸提液母液的制備 將黃牛毛蘚植物體洗凈，以無(wú)菌水浸泡至吸水飽和，然后用滅菌濾紙吸去體表多余水分，但不能過(guò)重?cái)D壓。用電子天平稱取8.0g蘚體，加少許無(wú)菌水，研磨成漿狀，再加水至50mL，然后放入50℃恒溫水浴鍋內(nèi)浸提24h。以4 000r/min離心10min，收集上清，得上清液即為水提液，然后補(bǔ)水至50mL，即得濃度為160mg/mL的黃牛毛蘚配子體水浸提母液。

1.2.2 黃牛毛蘚水浸提液的稀釋 用5mL的無(wú)菌移液管吸取160mg/mL的黃牛毛蘚水浸提液5mL，沿管壁慢慢注于裝含有15mL滅菌蒸餾水的三角瓶中，重復(fù)3次，共吸取160mg/mL的黃牛毛蘚水浸提液15mL，充分震蕩使混合均勻，即得30mL濃度為80.0mg/mL的水浸提液。另取一支無(wú)菌移液管，按上述操作方法，作2倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋1次，即更換1次無(wú)菌移液管，依次稀釋得到濃度為40.0mg/mL，20.0mg/mL，10.0mg/mL，5.0mg/mL，2.5mg/mL的黃牛毛蘚配子體水浸提液。將配制好的蘚體水提液置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?

1.2.3 大莖點(diǎn)霉活化 取大莖點(diǎn)霉的備用菌株，在已殺菌的超將工作臺(tái)中用接種環(huán)各取少許菌苔，接種至PDA固體培養(yǎng)基平板的中央，將已接種大莖點(diǎn)霉的平板置于恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，即可得到活化的菌株。待其菌落將要長(zhǎng)滿平板時(shí)，即進(jìn)入下一步操作。

1.2.4 抑菌效果測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[1]測(cè)定黃牛毛蘚水浸提液對(duì)大莖點(diǎn)霉生長(zhǎng)的影響。將PDA固體培養(yǎng)基在電爐上加熱溶化，待冷卻后，倒平板。待平板徹底冷卻凝固后，在無(wú)菌室內(nèi)用無(wú)菌移液槍吸取黃牛毛蘚水浸提液200μL，加入已冷卻的PDA固體培養(yǎng)基的平板上，火焰灼燒已滅菌的涂布棒，待涂布棒冷卻后涂布平板。用無(wú)菌打孔器在已活化的大莖點(diǎn)霉的同一生長(zhǎng)圈上打孔，得到直徑為1cm的菌落塊，并移入上述已制備好的平皿中央，每皿一塊，用相應(yīng)的提取溶劑無(wú)菌水作對(duì)照，每個(gè)濃度5次重復(fù)。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。培養(yǎng)3d后，觀察大莖點(diǎn)霉的的生長(zhǎng)情況，以十字交叉法測(cè)量菌落直徑。依下式計(jì)算抑菌率：

抑菌率（%）=[（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）-（處理菌落直徑-菌餅直徑）]/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100。

1.3 數(shù)據(jù)的處理與分析 試驗(yàn)結(jié)果中數(shù)據(jù)為5個(gè)平行樣的平均值。均采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，并運(yùn)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析（LSD多重比較及Duncan's檢驗(yàn)）及Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃牛毛蘚水提液的抑菌效果分析 本試驗(yàn)采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行。由表1可知，在較低濃度（2.5mg/mL及5.0mg/mL）下，黃牛毛蘚水浸提液對(duì)大莖點(diǎn)霉菌絲的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的抑制作用，但抑菌效果不明顯；隨著黃牛毛蘚水浸提液濃度的升高，大莖點(diǎn)霉菌絲生長(zhǎng)受到越來(lái)越強(qiáng)的抑制，菌落直徑迅速減小；當(dāng)水提液濃度達(dá)到20mg/mL時(shí)，抑菌率接近50%；而在較高濃度（大于40mg/mL）條件下，大莖點(diǎn)霉菌所受抑制作用明顯增強(qiáng)，抑菌率達(dá)到60%以上；本試驗(yàn)最高處理濃度（160mg/mL）水提液對(duì)大莖點(diǎn)霉菌的抑制率達(dá)到70%以上（72.55%）。并且，單因素方差分析表明，黃牛毛蘚水浸提液各濃度處理?xiàng)l件下的大莖點(diǎn)霉菌落大小均顯著小于對(duì)照組。另?yè)?jù)觀察發(fā)現(xiàn)，中高濃度處理下的大莖點(diǎn)霉菌，其菌絲密度小、生長(zhǎng)量減少，且菌絲較易老化。

3 討論與結(jié)論

黃牛毛蘚俗稱金牛毛、刀口藥，系牛毛蘚科（Ditrichaceae）牛毛蘚屬（Ditrichumhampe）植物，是我國(guó)藥用蘚類植物中常見(jiàn)的一種[9-10]。該蘚全草入藥，味淡、性涼，有鎮(zhèn)驚、清熱涼血及化瘀生肌的功效，多用于治療小兒驚風(fēng)、咳血、吐血及跌打損傷等癥[9]，在我國(guó)民間多有使用。本研究以冬棗輪紋病致病菌為受試菌株，結(jié)果表明：黃牛毛蘚水粗提液對(duì)沾化冬棗輪紋病致病菌大莖點(diǎn)霉的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌強(qiáng)度與浸提液濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系（p<0.05）。但本試驗(yàn)僅是就黃牛毛蘚對(duì)植物源致病菌抑制作用的初步測(cè)定，今后仍需開(kāi)展深入研究，闡明黃牛毛蘚體內(nèi)次生活性物質(zhì)的組成成分與含量水平，并進(jìn)一步優(yōu)化和篩選提取條件，才有可能制備出抗冬棗輪紋病的植物源殺菌劑，應(yīng)用到植物病害生物防治的實(shí)踐中。

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