環(huán)介導等溫擴增技術的假陽性擴增研究

王德國，王永真，王愛萍

(1．許昌學院食品與生物工程學院，河南省博士后研發(fā)基地，河南許昌461000;2．許昌學院公共實驗中心，河南 許昌461000;3．鄭州大學生命科學學院，河南 鄭州450000)

日本學者Notomi等2000年發(fā)明報道了環(huán)介導等溫擴增技術［1］，據(jù)谷歌統(tǒng)計截至目前該報道已被引用2146次，該技術通過多對引物巧妙實現(xiàn)擴增，環(huán)介導等溫擴增反應效率非常高，因為無溫度變化的耗時，后來環(huán)引物的提出進一步縮短了反應時間［2］，因此環(huán)介導等溫擴增在反應速度、特異性、靈敏度方面優(yōu)于鏈式聚合酶反應(PCR)［3，4］、酸序列依賴性擴增(NASBA)［5，6］、鏈替代擴增反應(SDA)［7］、滾換擴增反應(RCA)［8］和解鏈酶擴增(HAD)［9］，然而，在科技成果快速轉(zhuǎn)化的當今時代，環(huán)介導等溫擴增技術經(jīng)過十多年的研究開發(fā)，仍然沒有實際應用，主要由于這種核酸擴增檢測方法假陽性率高，本研究旨在研究分析引起假陽性擴增的主要原因，為環(huán)介導等溫擴增技術的實際應用提供理論與實踐基礎．

按照Notomi等2000年所報道的試驗設計引物，以相同的反應體系與擴增條件開展實驗，而本實驗結(jié)果與所報道的完全不同．

1 實驗材料與方法

1．1 引物

采用Notomi等報道中針對M13的環(huán)介導等溫擴增引物，由生物工程(上海)有限公司合成，如表1所示．

表1 環(huán)介導等溫擴增引物

1．2 DNA 模板

實驗室沒有M13DNA模板，因此，在本研究中也就不存在模板引起的氣溶膠污染及交叉污染問題．

1．3 環(huán)介導等溫擴增反應

按照Notomi等報道的反應體系與反應條件進行擴增反應，只是所有的反應管中均不加DNA模板，加入不同引物組合(FIP+BIP+F3+B3;FIP+BIP+F3;FIP+BIP+B3;FIP+BIP;F3+B3)各種引物的濃度與Notomi等報道的相同，擴增后2%的瓊脂糖凝膠電泳，重復三次．

2 結(jié)果與分析

如圖1所示，其中四種引物組合(FIP+BIP+F3+B3;FIP+BIP+F3;FIP+BIP+B3;FIP+BIP)均能非特異擴增，并且具有典型的LAMP梯度條帶，而Notomi等報道的試驗中陰性對照沒有擴增，并且沒有典型的LAMP梯度條帶［1］．

目前該領域的科研工作者普遍認為環(huán)介導等溫擴增技術靈敏度高，容易產(chǎn)生氣溶膠污染，交叉污染是導致假陽性率高的主要原因，在實現(xiàn)不開蓋檢測方面做了大量研究與嘗試，如濁度法檢測［10］、實時濁度法檢測［11］、熒光染料檢測［12-14］、免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垯z測［15］、使用指示劑羥基萘酚藍檢測［16，17］以及日本榮研公司的鈣黃綠素檢測，擴增產(chǎn)物的檢測手段近乎非常完美，但不開蓋檢測并沒有把環(huán)介導等溫擴增推向?qū)嶋H應用，正如本研究結(jié)果所表明的，引起環(huán)介導等溫擴增假陽性的主要原因不是氣溶膠污染，而是引物的非特異性擴增．環(huán)介導等溫擴增通過多對引物實現(xiàn)巧妙擴增，使用多對引物難免會形成引物二聚體和出現(xiàn)非特異性擴增，特別是在環(huán)介導等溫擴增反應中引物、鎂離子、dNTP和酶的濃度比Real-time PCR中的高好幾倍，在Real-time PCR研究中，為了避免非特性擴增需要嚴格控制這四個因素的濃度．在本研究中，甚至一對內(nèi)引物就可以非特異性擴增，因此，目前環(huán)介導等溫擴增技術只是理想的分子模型，在該技術的應用研究中應致力于解決非特異性擴增問題．

圖1 不加模板的情況下環(huán)介導等溫擴增結(jié)果

3 結(jié)論

環(huán)介導等溫擴增技術推廣應用的瓶頸是假陽性率高，導致假陽性率高的主要原因是引物二聚體引起的非特異性擴增，其次是氣溶膠污染．本研究的創(chuàng)新之處在于首次發(fā)現(xiàn)限制環(huán)介導等溫擴增技術推廣應用的真正原因所在．

［1］ T．Notomi，H．Okayama，H．Masubuchi，T．Yonekawa，K．Watanabe，N．Amino，and T．Hase．Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA［J］．Nucleic Acids Res，2000，28(12):E63．

［2］ K．Nagamine，T．Hase，and T．Notomi．Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplication using loop primers［J］．Mol Cell Probes，2002，16(3):223-229．

［3］ R．K．Saiki，S．Scharf，F(xiàn)．Faloona，K．B．Mullis，G．T．Horn，H．A．Erlich，and N．Arnheim．Enzymatic amplification of β -globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia［J］．Science，1985，230(4732):1350-1354．

［4］ R．K．Saiki，D．H．Gelfand，S．Stoffel，S．J．Scharf，R．Higuchi，G．T．Horn，K．B．Mullis，H．A．Erlich．Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase［J］．Science，1988，239(4839):487-491．

［5］ J．Compton．Nucleic acid sequence-based amplification［J］．Nature，350(6313):91-92，1991．

［6］ E．Fahy，D．Y．Kwoh，and T．R．Gingeras．Self-sustained sequence replication(3SR):an isothermal transcription-based amplification system alternative to PCR［J］．Genome Res，1991，1(1):25-33．

［7］ G．T．Walker，M．S．Fraiser，J．L．Schram，M．C．Little，J．G．Nadeau，and D．P．Malinowski．Strand displacement amplification—an isothermal，in vitro DNA amplification technique［J］．Nucleic Acids Res，1992，20(7):1691-1696．

［8］ P．M．Lizardi，X．Huang，Z．Zhu，P．Bray-Ward，D．C．Thomas，and D．C．Ward．Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplication ［J］．Nat Genet，1998，19(3):225-232．

［9］ M．Vincent，X．Yan，and H．Kong．Helicase-dependent isothermal DNA amplification［J］．EMBO reports，2004，5(4):795-800．

［10］ Devika P，Manojkumar B，Mohanakumaran N，et al．Optimisation of reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection ofMacrobrachium rosenbergiinoda virus and extra small virus inMacrobrachium rosenbergii［J］．Journal of Virological Methods，2010，167(1):61-67．

［11］ Perera N，Aonuma H，Yoshimura A，et al．Rapid identification of virus-carrying mosquitoes using reverse transcription-loopmediated isothermal amplification［J］．Journal of Virological Methods，2009，156(1-2):32-36．

［12］ Ren X F，Li P C．Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus［J］．Virus Genes，2011，42(2):229-235．

［13］ Prompamorn P，Sithigorngul P，Rukpratanporn S，et al．The development of loop-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick for detection ofVibrio parahaemolyticus［J］．Letters in Applied Microbiology，2011，52(4):344-351．

［14］ Tani H，Teramura T，Adachi K，et al．Technique for Quantitative Detection of Specific DNA Sequences Using Alternately Binding Quenching Probe Competitive Assay Combined with Loop-Mediated Isothermal Amplification［J］．Analytical Chemistry，2007，79(15):5608-5613．

［15］ Lee M F，Chen Y H，Peng C F．Evaluation of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification in conjunction with ELISA hybridization assay for molecular detection ofMycobacterium tuberculosis［J］．Journal of Microbiological Methods，2009，76(2):174-180．

［16］ Tereza C．Cardoso，Heitor F．Ferrari，Lívia C．Bregano，et al．Visual detection of turkey coronavirus RNA in tissues and feces by reverse-transcription loop-mediated isothermal amplication(RT-LAMP)with hydroxynaphthol blue dye［J］．Molecular and Cellular Probes，2010，24(6):415-417．

［17］張 侃，蔣 菲，張躍偉，等．羥基萘酚藍在偽狂犬病病毒環(huán)介導等溫擴增檢測方法中的應用［J］．農(nóng)業(yè)生物技術學報，2011，19(6):1075-1080．