等溫擴增技術(shù)在檢測食品中金黃色葡萄球菌的應(yīng)用

◎蘭 瑩

（四川省疾病預(yù)防控制中心，四川 成都 610021）

金黃色葡萄球菌簡稱金葡菌，是微球菌科葡萄球菌屬，分布廣泛。金葡菌能夠在人體的黏膜、鼻咽等處寄殖，因此在食品加工生產(chǎn)過程中，極易通過加工、銷售等人員帶菌導(dǎo)致污染，最終造成食物中毒事件的出現(xiàn)。通常情況下，容易遭受金葡菌污染度的食品包括：生/熟肉、乳和乳制品、蛋和蛋制品等等。當前，金葡菌已經(jīng)成被列入我國食品衛(wèi)生微生物檢驗的常規(guī)檢測項目。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗設(shè)備

PCR 擴增儀；5417R離心機；SPX-150B-Z 生化培養(yǎng)箱；DNA/RNA/蛋白分析儀；UVIpro 凝膠成像系統(tǒng)[1]。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、Baird-Parker 氏培養(yǎng)基、增菌劑、7.5%氯化鈉肉湯、血瓊脂平板、Petrifilm RSA.Count Plate、Baird-parker+RPFAgar。

1.1.3 生化試劑

LAMP反應(yīng)試劑、PCR 反應(yīng)試劑、引物、TE 緩沖液、TAE電泳緩沖液、溴化乙錠、配制瓊脂糖凝膠、500 mmol/LEDTA溶液、1 mol/LTris-HCl、10%SDS等等。

1.1.4 試驗樣品

通過無菌操作的方式在當?shù)刂饕袌鲑徺I200份的試驗樣品，其分別為鮮牛乳、牛肉、雞肉、豬肉以及其余肉制品，其中牛乳和肉制品分別準備60份和50份，其余均為30份。

1.2 試驗方法

為了實現(xiàn)對等溫擴增檢測金葡菌的靈敏度以及人工污染檢出限的有效對比，本試驗分別采取了等溫擴增檢測技術(shù)（LAMP）和聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)（PCR）。

1.2.1 LAMP 試驗方法

LAMP反應(yīng)是在水浴鍋內(nèi)開展的，先令其在64℃水浴鍋內(nèi)進行反應(yīng)，反應(yīng)時間控制在20分鐘，再令其在80℃水浴鍋內(nèi)繼續(xù)反應(yīng)，10分鐘后反應(yīng)結(jié)束。

反應(yīng)完成后，用肉眼對反應(yīng)體系濁度的變化情況進行觀測，并通過高速離心的方式，驗證管底是否存在白色的焦磷酸鎂沉淀。此外，還需使用5μL的擴增產(chǎn)物和1μL6×lodding buffer進行混合，通過凝膠成像系統(tǒng)對1.5%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果進行觀察和成像，看是否存在梯形條帶，LAMP 反應(yīng)是否已經(jīng)發(fā)生[2]。

1.3 PCR試驗方法

PCR的整個反應(yīng)過程主要是在PCR 儀內(nèi)開展的，第一步預(yù)變性94℃，保持4分鐘；第二步是變性94℃，保持1分鐘；第三步是退火58℃，保持0.5分鐘；第四步延伸72℃，保持1.5分鐘，循環(huán)35；第五步延伸72℃，保持3.5分鐘。

使用5μL的PCR 產(chǎn)物和1μL6×lodding buffer進行混合，過凝膠成像系統(tǒng)對1.5%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果進行觀察和成像，

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測金葡菌靈敏度分析

在本試驗中，原始菌液的濃度是2.5×109CFU/mL，將其稀釋了108倍后，通過LAMP進行反應(yīng)，依舊發(fā)現(xiàn)存在白色的焦磷酸鎂沉淀，能夠看到梯形條帶；當菌液的濃度稀釋到了109倍時，則沒有任何沉淀和梯形條帶。對于PCR反應(yīng)而言，當菌液的濃度稀釋到106倍時，還存在特異性條帶，繼續(xù)進行稀釋，則沒有任何反應(yīng)。如下圖1所示即為LAMP和PCR檢測金葡菌敏感性比較示意圖。

圖1 LAMP和PCR檢測金葡菌敏感性比較示意圖

根據(jù)上述結(jié)果，可以得出LAMP反應(yīng)檢測金葡菌靈敏度更高。

2.2 食品中金葡菌檢出限分析

在試驗中，使用濃度2.06×109CFU/mL的菌液對食品進行人工污染，然后再將金葡菌的 DNA提取出來，使用LAMP與PCR方法對進行試驗。

當菌液濃度稀釋到了107倍時，通過LAMP進行反應(yīng)，依舊發(fā)現(xiàn)存在白色的焦磷酸鎂沉淀，能夠看到梯形條帶；當菌液的濃度稀釋到了108倍時，則沒有任何沉淀和梯形條帶，因此LAMP法對人工食品中金葡菌檢出限是2.06×102CFU/mL。對于PCR反應(yīng)而言，當菌液的濃度稀釋到106倍時，就無法檢測到金葡菌。如圖2所示即為LAMP和PCR檢測食品中金葡菌檢出限比較示意圖。

圖2 LAMP和PCR檢測食品中金葡菌檢出限比較示意圖

根據(jù)上述結(jié)果，可以得出LAMP反應(yīng)檢出限是PCR反應(yīng)的100倍。

3 討論

為了進一步驗證等溫擴增技術(shù)在檢測食品中金黃色葡萄球菌的應(yīng)用效果，本試驗分別采用LAMP方法和PCR方法檢測了200份的食品樣品。通過試驗發(fā)現(xiàn)，使用LAMP方法檢測食品中金黃色葡萄球菌，僅僅需要60分鐘即可，其中30分鐘用于提取金葡菌 DNA，20分鐘用于擴增，因此檢測速度十分迅速，在食品安全監(jiān)督管理中的可行性更高[3]。

將LAMP方法和PCR方法進行比較可以發(fā)現(xiàn)，LAMP 方法在對金葡菌 DNA進行提取時，沒有十分嚴格的要求，相關(guān)的抑制因素也較少，尤其是對于擴增產(chǎn)物的檢測更為容易，可以用肉眼直接觀察是否生成沉淀，從而把握靶序列擴增與否。使用LAMP方法檢測金黃色葡萄球菌不需要使用電泳與紫外進行觀察，檢測步驟方便簡潔、檢測精度更高，因此十分適用于技術(shù)、資金較為薄弱的基層檢測機構(gòu)，同時LAMP方法在現(xiàn)場快速檢測中也具有較高的優(yōu)勢，值得推廣應(yīng)用。

[1]徐義剛,李蘇龍,李丹丹,等.食品中金黃色葡萄球菌DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增快速檢測方法的建立與應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,(8).

[2]朱水榮,丁水軍.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增PCR技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌毒素基因的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜誌,2010(20).

[3]唐夢君,周生,葛慶聯(lián),等.應(yīng)用LAMP快速檢測金黃色葡萄球菌的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2011(27).