抗菌肽在飼用枯草芽孢桿菌中表達的研究進展

李連彬，陳秀麗

（1.西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.陜西省漢中市動物疾病預防控制中心，陜西漢中 723100）

由于抗生素藥物的濫用，出現了越來越多的抗生素耐藥菌株，傳統抗生素替代藥物的開發已成為目前研究熱點。在生物機體中分離出的抗菌肽被認為是一種最有潛力的抗菌類藥物。抗菌肽一般含有10～50個氨基酸，整體帶有2～9個的正電荷，較大部分（≥30%）的疏水性氨基酸（Hancock和Sahl，2006）。抗菌肽具有抗菌譜廣、抗菌活性高、不易產生耐藥性、無毒副作用 （僅少數種類具有溶血活性）、無殘留與無污染等優點，符合畜產品安全生產的需要，適合在飼料生產中使用，具有作為新一代飼料添加劑的潛質（單安山等，2012）。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是廣泛存在于土壤和動物胃腸道的一類革蘭氏陽性菌，目前已作為重要的工業菌種被越來越多地應用于畜牧業生產中。枯草芽孢桿菌具有易于分離培養、較清晰的遺傳背景、良好的分泌性及無致病性等優點。近幾年來利用重組枯草芽孢桿菌生產飼用酶、飼用活性代謝產物以及作為腸道益生菌成為熱點研究領域。本文對枯草芽孢桿菌表達系統及抗菌肽在其中的表達進行了簡要的綜述，以期為開發飼用型抗菌制劑提供參考。

1 枯草芽孢桿菌表達系統

枯草芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，是一類好氧型、內生抗逆性孢子的革蘭氏陽性菌。其細胞呈直桿狀，大小為（0.8 ～ 1.2）μm×（1.5 ～ 4.0）μm，廣泛分布于土壤及腐敗的有機物中。因其培養簡單快速，具有較強的分泌蛋白質的能力、非致病性及良好的發酵基礎和生產技術，故枯草芽孢桿菌是目前生產各種工業用酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的理想表達宿主，是微生物研究領域中的一種重要模式菌株。

枯草芽孢桿菌具有自己獨特的生長規律：生長延滯期、對數期、穩定期、衰亡期及芽孢發育期。其在不同的生長階段基因表達不同，有多種不同時序性的 σ因子來調節 （Staroń等，2009）。 楊明明（2013）利用電轉化介導枯草芽孢桿菌早期生孢基因的敲除，獲得了枯草芽孢桿菌生孢基因缺失株B.subtilis GJ09。枯草芽孢桿菌表達系統的另一個特點是其能將蛋白大量分泌至培養基中，通過生物信息學預測，枯草芽孢桿菌共有294種外分泌型蛋白。但是由于其胞外蛋白酶表達量大反而容易引起目標蛋白的降解，目前通常的解決方法是采用蛋白酶缺陷株作為宿主（Nijland 和 Kuipers，2008）。

雖然與大腸桿菌表達系統相比枯草芽孢桿菌表達系統更適合應用到制備飼用酶及抗菌制劑中，但是其嵌合載體拷貝數低、啟動子活性低，導致目標基因表達量低等問題。近幾年的研究主要圍繞著如何構建高拷貝的載體、篩選高活性的啟動子等內容。

1.1 枯草芽孢桿菌載體系統 在微生物的遺傳操作中，質粒載體是基因重組技術中的重要工具。然而大部分枯草芽孢桿菌不含內源性質粒。目前常用的質粒一般來源于葡萄球菌和鏈球菌，其中應用效果較好的是采用滾環型復制的小型質粒。但是質粒仍然存在分離不穩定，結構不穩定等問題（Tanaka等，2010）。這嚴重影響了其在枯草芽孢桿菌的研究應用，此外在枯草芽孢桿菌的遺傳操作中，體外連接的雙鏈質粒DNA分子直接轉化宿主效率極低。許多基因不能直接構建枯草芽孢桿菌質粒載體，轉入宿主菌進行表達。然而，大腸桿菌分子遺傳操作成熟，不會產生質粒不穩定性現象，因此可以將外源基因在大腸桿菌中構建完成后再轉化到枯草芽孢桿菌中表達。故構建大腸桿菌-枯草芽孢桿菌的穿梭質粒載體是十分必要，目前常用的穿梭質粒載體有 pEB10、pEB20、pEB60、pUB18、pUB19 和 pWB980，還有能夠實現在枯草芽孢桿菌中高效表達的pHT01和pHT43（余小霞等，2015；Nguyen 等，2007）。 李瑞芳等（2006）用大腸桿菌質粒pSP72和枯草桿菌質粒Pub18共整合得到雙功能克隆載體pSB。楊明明（2013）從質粒的大小、多克隆位點的合理布局、抗性標記的便利性、質粒提取的便利性以及復制子特性等角度出發，構建了新的結構緊湊的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pGJ03及pGJ148。

1.2 枯草芽孢桿菌表達系統的啟動子 啟動子是位于結構基因 5'端上游的 DNA序列，能夠活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確的結合并具有轉錄起始的特異性。獲得高活性的啟動子是實現外源基因高效表達的關鍵。在枯草芽孢桿菌表達系統中常用的啟動子主要分為2個類型：組成型啟動子和誘導型啟動子。組成型啟動子即持續性表達蛋白的啟動子，如P43啟動子（Chiang等，2010）。這類啟動子啟動強度通常要求較強，且成本低，一些組成型啟動子常通過構建胞內或分泌表達載體表達目的蛋白，但存在對宿主生長有害的蛋白難以表達和可控性差的缺陷 （Ying等，2011）。誘導型啟動子可以根據需要調控基因的表達。常用的誘導型啟動子主要有4類：Pspac、Pxyl、PsacB和Pglv。Pspac由SPO1的啟動子和大腸桿菌乳糖操縱元的阻遏蛋白結合位點嵌合而成，由IPTG誘導表達（Knobloch等，2011）。但是IPTG價格高且有毒性，Pspac啟動強度還是不夠。Pxyl啟動子是由木糖誘導表達的一類啟動子，該系統調控嚴謹，誘導效率高但是卻受葡萄糖抑制。PsacB啟動子則是利用自身的可控元件來實現外源基因的誘導表達。其表達量偏低。Pglv是目前有很好的應用潛力的啟動子系統，其誘導物麥芽糖相對于IPTG和木糖來說價格便宜、成本低且對細菌本身無毒性，因此在工業生產上很有實用性價值，但是葡萄糖對其有抑制作用（楊明明和陳玉林，2013）。Yang等（2010）改善了Pglv啟動子系統，大大降低了葡萄糖的抑制作用。

2 抗菌肽在枯草芽孢桿菌表達系統中的表達

如上所述枯草芽孢桿菌表達系統目前還不是很完善。但是其對于飼用抗菌制劑的開發具有獨特的優點，加上近幾年這個系統的逐漸成熟，人們逐漸將抗菌肽的表達轉移到枯草芽孢桿菌上來。目前，大約有2300多種抗菌肽被發現，不同的抗菌肽具有不同的抑菌譜。對于枯草芽孢桿菌表達系統來講，那些對革蘭氏陰性菌有高殺傷力而對革蘭氏陽性菌沒有殺傷力的抗菌肽可以采用直接表達的方法；而對于大部分既能殺滅革蘭氏陰性菌又對革蘭氏陽性菌有殺傷力的抗菌肽必須采用融合表達的策略。

2.1 直接表達 在畜牧業生產中，很多致病菌是革蘭氏陰性菌，如常見的雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和引發仔豬白痢的大腸桿菌等。因此部分對革蘭氏陰性菌有高殺傷力而對革蘭氏陽性菌沒有殺傷力的抗菌肽在畜牧業生產中具有重要意義。李麗等（2009）利用抗菌肽Abaecin對革蘭氏陰性菌有很強的殺傷力，而對革蘭氏陽性菌沒有殺傷力這一特點選擇了枯草芽孢桿菌作為表達宿主菌。利用重疊PCR獲得了Abaecin的基因序列AP，將 AP、質粒 pHCMC05的啟動子 Pspac及阻遏蛋白基因LacI和質粒pAX01的終止子t0t1插入大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質粒pGJ103中構建了新型表達質粒pGplat，并利用麥芽糖誘導表達抗菌肽Abaecin。在枯草芽孢桿菌的發酵液中檢測到了抗菌肽Abaecin，其生物活性得到也驗證。岳敏杰（2013）利用枯草芽孢桿菌表達質粒pWB980為骨架構建了大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質粒pWBAO，在枯草芽孢桿菌中表達了雞干擾素ChlFN-a，利用蔗糖進行誘導表達，但是產量較低。雖然通過直接表達可以獲得一些抗菌肽，但是大部分抗菌肽具有廣譜的抗菌性，想要得到必須通過融合表達的方法獲得。

2.2 融合表達 廣譜的抗菌肽在枯草芽孢桿菌系統中表達面臨2個難題：抗菌肽的抗菌特性使其對宿主菌具有潛在的致命毒性；抗菌肽小分子量和高陽離子性使其易被蛋白水解酶降解。而采用融合表達可以克服這兩個難題。Chen等（2009）利用SUMO融合技術首先在枯草芽孢桿菌中表達出了廣譜性的抗菌肽Cecropin AD，將SUMO融合蛋白和SUMO切割酶構建到同一個質粒載體中，從而實現將廣譜性抗菌肽Cecropin AD直接表達到發酵液中。陳香等 （2011）和王阿榮等（2011）將利用此種方法表達的抗菌肽直接添加到了仔豬的日糧中，結果表明這種抗菌肽制劑可顯著改善飼料轉化率，降低飼料成本，提高斷奶仔豬的生產性能和機體免疫性能。但是用這種方法獲得抗菌肽的產量偏低，不能達到工業化生產的水平。 欒超（2014）比較了 3 種融合技術（Trx、Gst和SUMO）對抗菌肽CBF表達量的影響，證實SUMO融合技術效果最好。為了提高產量，其在枯草芽孢桿菌系統中分別表達SUMO融合蛋白和SUMO切割酶，但是其過程因多了一步體外切割，故較繁瑣。為了簡化表達純化抗菌肽的過程，He等（2015）利用內含肽自切割技術首次在枯草芽孢桿菌中表達出了抗菌肽CBF，并且純化過程只需一步，較為簡單，但是產量很低，離工業化生產的目標相距較遠。謝海偉等（2011）和尚田田（2014）均在枯草芽孢桿菌中表達獲得抗菌肽。近年來，利用枯草芽孢桿菌表達的抗菌肽所采用的方法、融合系統和產量等指標見表1。

表1 抗菌肽在枯草芽孢桿菌中的表達

3 小結

目前，隨著枯草芽孢桿菌基因工程不斷的發展完善，越來越多的與工業發酵相關的基因獲得成功表達。但是相對于大腸桿菌表達系統其還有很多需要改進的地方，如構建更小、拷貝數高的新型質粒載體；進一步提高質粒的穩定性與安全性；遺傳操作方法需要進一步優化，尤其要解決枯草芽孢桿菌轉化效率偏低的問題；篩選更強的啟動子。可以預見，隨著這些問題的解決，枯草芽孢桿菌將具有更為廣闊的應用前景。

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