水平振搖在骨髓間充質干細胞提純中的作用

·基礎研究·

水平振搖在骨髓間充質干細胞提純中的作用

王偉恒，鄧國英，徐立璋，程自申，楊向群，葉曉健

作者單位：200003上海， 第二軍醫大學附屬長征醫院骨科

通信作者：葉曉健yexj2002@163.com

【摘要】目的研究水平振搖對全骨髓貼壁分離大鼠骨髓間充質干細胞在細胞數量、純度、凋亡及遠期增殖及分化能力的影響，探索更為簡單、高效的間充質干細胞提純方法。 方法在全骨髓貼壁法的基礎上，使用水平搖床，以180 r/min、4 h為干預條件，水平振搖后計算貼壁細胞總數量；使用流式細胞儀測定貼壁細胞純度及凋亡情況；使用MTT法測定振搖后貼壁細胞24 h的增殖情況；對分離純化后細胞使用定向誘導培養基進行誘導分化。結果經振搖處理后，獲得的細胞總量有所下降，細胞純度顯著提升，凋亡略有增加，增殖情況變化不大，具有向成骨細胞和脂肪細胞分化的能力。結論水平振搖法可顯著提高全骨髓貼壁法的提純效率，具有推廣價值。

【關鍵詞】大鼠; 骨髓; 間質干細胞; 分離和提純;

基金項目：國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2013AA032203)

作者簡介：王偉恒(1989— )， 碩士在讀，醫師

【中圖分類號】R 329.28 【文獻標志碼】 A

DOI【】

收稿日期：(2014-10-12)

Exploration of horizontal shaking for bone marrow mesenchymal stem cells purificationWANGWei-hang,DENGGuo-ying,XULi-zhang,CHENGZi-shen,YANGXiang-qun,YEXiao-jian.DepartmentofOrthopaedics,ChangzhengHospital,SecondaryMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200003，China

Abstract【】ObjectiveTo study the effects of horizontal shaking on cell purity, activity, apoptosis, and differentiation in the process of the in vitro isolation and purification of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). Even the shaking effect for the cells proliferation, differentiation ability in the future. To establish a simpler and more efficient method for BMSCs purification. Methods Based on the whole bone marrow adhesion method, BMSCs isolated and purified by using different attachment method and shaking treatment of 180 r/min for 4 h, and then analyzed the adherent cell state including cell counting by cells counter; cell purity and apoptosis by flow cytometry; cells proliferation after shaking 24 h by MTT method; cells differentiation by directional induction medium. ResultsAfter shaking, cell count was decrease, purity was increased, apoptosis was increased, proliferation had no change, and the harvested cells had the ability to differentiate into osteoblasts and adipocytes. ConclusionThe whole bone marrow adhesion method combined with appropriate shaking is more efficient and worth popularizing.

【Key words】Rats; Bone marrow; Mesenchymal stem cells; Isolation & purification;

J Spinal Surg, 2015,13(1):45-49

近年來，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)作為種子細胞在脊髓損傷[1-3]、椎間盤退變[4-6]和纖維環修復[7-8]等脊柱外科領域備受關注。但因其在骨髓中含量低，體外培養易分化和老化[9],獲得足夠數量的高純度、高活性、低分化的間充質干細胞是進行相關研究的重要基礎。

目前從骨髓中提純BMSCs方法主要包括：全骨髓貼壁法[10]、密度梯度離心法[11]、流式細胞儀分離法[12]、免疫磁珠分離法[13]。全骨髓貼壁法是根據細胞貼壁能力的差異篩選間充質干細胞，此法簡單易行，但得到的細胞純度較低。密度梯度離心法操作繁復，提取細胞純度較高，但生長緩慢活性低，原代細胞首次融合時間長[14]。流式細胞儀分離法和免疫磁珠分離法是利用特異性抗體篩選BMSCs，提取效率較高，但對細胞正常生理有影響，且成本高難以普及[12-13]。因此尋找一種簡單高效的提取方法，對BMSCs的推廣研究具有特殊意義。

從骨髓中分離純化的間充質干細胞主要混有成纖維細胞和造血系細胞。在這幾種細胞中成纖維細胞的貼壁能力最強，BMSCs次之，造血系細胞較弱[10]。本研究借鑒小膠質細胞和少突膠質細胞前體細胞的分離純化方法[15]，在全骨髓貼壁法的基礎上利用水平振搖對BMSCs進行分離純化。研究機械振搖在純化BMSCs中的作用以及對細胞增殖分化的影響，最終簡便而高效的從大鼠骨髓中成功分離培養出高純度的BMSCs，并將其誘導分化為成骨細胞和脂肪細胞。

1材料和方法

1.1試劑和儀器

清潔級SD大鼠(第二軍醫大學實驗動物中心)，雌雄不限，體重(100±10) g；5 mL一次性注射器，DMED-F12培養基(Gibco，美國)，胎牛血清(Gibco，美國)，T75培養瓶(corning，美國)，大培養皿(corning，美國)，三抗(Gbico，美國)，無EDTA 0.25%胰酶(GIBCO)，BMSC成骨成脂誘導分化培養基(Cyagen,美國)，CD45,CD31,CD90,CD29 流式分析抗體及同型對照(BD，美國)，細胞凋亡檢測試劑盒(BD，美國)，MTT增殖活性試劑盒(碧云天，中國)。

1.2BMSCs原代細胞的獲取

根據文獻[10, 20]中報道方法并適當改良 ，取12只SD大鼠CO2窒息處死后，置于75%酒精中浸泡10 min，于無菌條件下取出雙側股骨和脛骨，剪除兩端骨骺，用5 mL注射器吸取DMEM培養液從長骨一端反復沖洗骨髓腔，離心后以完全培養基(10%FBS，DF-12，1%三抗)重懸。收集細胞懸液，以約平均2只/瓶的細胞總量，10 mL的培液體積，接種于6個T75培養瓶中。于37℃，體積分數5% CO2飽和濕度孵育箱中培養。24 h后換液，之后隔日換液。1周后可觀察到集落明顯形成，為實驗所用對象。每次實驗振搖前30 min更換培養液。

1.3實驗方法/干預

取6瓶同批次BMSCs原代細胞，隨機分為2組，每組各3瓶。一組于37℃水平搖床180 r/min振搖4 h(實驗組)，另一組不加處理(對照組)。振搖結束后棄上清，消化貼壁細胞后計數，經流式細胞儀檢測貼壁細胞CD45、CD31、CD90、CD29的表達情況，同時進行AnnexinⅤ-fitc+PI標記的細胞凋亡檢測。貼壁消化的細胞重新種于96孔板，24 h后MMT法測定貼壁細胞傳代后的增殖活性，另一批種于24孔板中進行成骨成脂誘導分化。

使用Counterstar全自動細胞計數儀計數處理前后貼壁細胞總數量。

流式細胞術測定BMSCs純度：相同條件下使用37℃、0.25%的胰酶將細胞消化后移至離心管內，以150×g(g=9.806 65 m/s2)離心，5 min后棄上清，按試劑盒說明書進行細胞準備，加入抗體及同型對照，染色15 min后，經PBS稀釋至500 μL，由流式細胞儀(FAC500)進行貼壁細胞CD29、CD90、CD45、CD31陽性率檢測，計算細胞純度，鑒定振搖的分離純化效果。

流式細胞術測定BMSCs凋亡：取同批次細胞，經上述消化離心調整密度后，取剩余細胞，按照試劑盒使用說明書染色后，行流式細胞儀檢測[21-22]。測定貼壁細胞凋亡率，評估貼壁細胞的凋亡情況。

MMT法測定振搖后細胞活性：將處理后與不處理的貼壁細胞消化后，以1×104/mL的細胞密度，每孔100 μL種于96孔板內，每瓶種3個孔，每組9個孔，20 h貼壁后，按照文獻[19]報道的方法檢測細胞活性，評估振搖處理對細胞后續增殖能力的影響。

體外分化潛能測定：經純度鑒定后，選取純度最高組以細胞密度1×105/mL，每孔1 mL接種于24孔板內，細胞貼壁后分別加入成骨、成脂誘導分化培養基，每3 d換液，3周后經4%多聚甲醛固定后分別以茜素紅和油紅O染色[23]，鏡下觀察分化指標。以茜素紅染色后骨結節的形成和油紅O染色后脂滴的形成來評價成骨成脂分化能力，評估振搖后的細胞分化潛能。

所有染色過程均按照產品說明書操作，染色后1 h內檢測拍照完畢。

1.4統計學分析

所得到的數據使用SPSS 21.0軟件(美國IBM公司)進行分析和處理，使用單因素方差分析法，進行2組間的比較。設定P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1振搖后貼壁細胞量及純度的結果

與對照組相比,水平振搖處理后，貼壁細胞的數量約下降1/3(見圖1a)，細胞CD29和CD90 2項指標陽性率均顯著上升，振搖后貼壁細胞的純度大幅提升(見圖1b-f)。CD45和CD31 2個陰性指標陽性率均<1%，對結果分析影響不大，故未在圖中顯示。

2.2振搖后貼壁細胞凋亡

流式細胞儀結果分析顯示振搖刺激可使貼壁細胞凋亡增加。實驗組和對照組間差異有統計學意義(P>0.05，見表1)，但在目前的干預條件下，凋亡水平均較低，振搖后凋亡率升高幅度不大(見圖2)。

a: 2組貼壁細胞量b: 對照組貼壁細胞CD29陽性率c: 實驗組組貼壁細胞CD29陽性率d: 對照組貼壁細胞CD90陽性率e: 實驗組組貼壁細胞CD90陽性率f: 2組貼壁細胞純度

a: Number of adherent cells of 2 groupsb: Control group CD29 positive rate of adherent cellsc: Experiment group CD29 positive rate of adherent cellsd: Control group CD90 positive rate of adherent cellse: Experiment group CD90 positive rate of adherent cellsf: Purity of adherent cells of 2 groups

圖12組貼壁細胞量及細胞純度

Fig.1Number and purity of adherent cells of 2 groups

表12組貼壁細胞的凋亡率

Tab.1Apoptosis rate for adherent cells of 2 gruoups

組別Groups早期凋亡Earlyapoptosis晚期凋亡Lateapoptosis總凋亡Totalapoptosis對照組Controlgroup1.13±0.214.53±0.705.67±0.76實驗組Experimentgroup1.53±0.617.23±0.72*8.77±0.21*

注：早期凋亡不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)；*晚期凋亡和總凋亡率明顯，差異有統計學意義(P<0.05)

Note：Early apoptosis was not obvious, difference has no statistically significant (P>0.05); *Late apoptosis and total apoptosis was obvious, difference has statistically significant (P<0.05)

a： 對照組b: 實驗組

a: Control groupb： Experiment group

圖22組貼壁細胞凋亡率

Fig.2Apoptosis of adherent cells of 2 groups

圖3成骨誘導3周后茜素紅染色情況(×400)

Fig.3Alizarin red staining after osteogenic induction 3 weeks(×400)

圖4成脂誘導3周后油紅O染色情況(×400)

Fig.4Red O staining after adipogenic induction 3 weeks(×400)

2.3振搖24 h后MTT檢測貼壁細胞增值能力

MTT檢測顯示振搖前后貼壁細胞均形成藍紫色結晶,全自動酶標儀顯示實驗組與對照組比色結果分別為0.299±0.013 82和0.304±0.025 17。2組間差異無統計學意義(P>0.05)。振搖對貼壁細胞的增值能力影響并不顯著。

2.4振搖后貼壁細胞成骨成脂誘導分化結果

用成骨誘導培養基對振搖處理后的貼壁細胞行誘導分化，成骨誘導培養3周后，茜素紅染色顯示細胞外基質中有鈣結節形成(見圖3)。成脂誘導培養7 d左右可見細胞形態有所改變并隨著誘導培養時間的延長，細胞中脂滴變大，誘導3周時油紅O染色結果顯示多數細胞的細胞質可見紅色脂滴(見圖4)。

3討論

雖然在實驗設計及操作中實驗人員采取了多種改進方法，但由于原代細胞提取本身的局限性，批次之間、各培養瓶內細胞量之間的差異不可避免，最終結果，批次間和培養瓶內細胞略有不同，但在實驗干預前后均出現穩定顯著差異，說明水平震搖的純化效果。在實驗操作中，原代細胞提取時統一重懸后平均接種于各培養瓶中，培養瓶內細胞差異不大。但大批量操作時實驗質量的可控性降低，故同一批次實驗時使用大鼠數量定為12只，平均分為2組，每組均勻接種與3個培養瓶，整個實驗在不同時間段內重復進行驗證。另外，因過高的細胞密度可導致干細胞分化[16-17]，因此選擇1周為時間節點以控制不同批次間細胞量的差異。即便如此，因批次之間基線不盡相同，不宜同時進行統計分析，但經多次重復實驗，振搖分離方法穩定性佳，振搖前后差異顯著，故本研究所展示為其中1組數據。而同一批次內，瓶與瓶之間在細胞狀態上不盡相同，雖經過重懸和平均分配，同組內不同培養瓶間差異仍無法完全避免，但因差異較小而未做進一步處理。

4個抗體的選擇上[18]，CD29和CD90 陽性指標在整個實驗中敏感性強，但CD45和CD31 陰性指標在整個實驗中皆處于極低水平，敏感性差，故未做處理分析。被搖晃下來的大量細胞因成分復雜，需要試驗性使用多種抗體進行鑒定，不屬于此次研究的重點，且不影響BMSCs純化結果的可靠性，因此未做鑒定。

參照小膠質細胞的分離方法，本研究選擇180 r/min、4 h作為干預條件[19]，明確證明通過物理刺激，即振搖法分離純化細胞的可行性。整體而言，在BMSCs的純化中，水平振搖法可引起培養液運動，產生對貼壁細胞的流體剪切力[20]，這對有較強貼壁能力的BMSCs的提純有顯著的優化作用[21]，從而實現不同貼壁能力細胞的分離。這也是經典的小膠質細胞和少突膠質細胞前體細胞分離的理論依據[19]。全骨髓貼壁法中，細胞分為造血系細胞和間充質干細胞，其中造血系的細胞貼壁能力較差而BMSCs貼壁能力較強[10]。因此，參照小膠質細胞和突膠質細胞前體細胞的分離方法進行BMSCs分離純化理論上是可行的。

從細胞的凋亡上看，貼壁細胞在流體剪切力作用下不斷凋亡、不斷脫壁，在不同的階段維持相對穩定的凋亡比例[22]。凋亡細胞的貼壁能力較低，較易脫壁，在較高振搖頻率下導致更易脫壁。從細胞總數量來看，雖然有接近1/3的細胞脫壁，但貼壁細胞中總凋亡率只有9%左右，因此在180 r/min，4 h水平振搖的條件下對于細胞的純化作用應遠大于其所造成的細胞損傷。

從分離后細胞活性看，水平振搖對貼壁細胞的活性影響并不顯著，但可實現細胞純度的顯著增高，細胞純度的增高可能更利于細胞的增殖活性。因此本方法具有實際應用的價值。

在混合培養體系中，一種細胞的純度增加可表現為該細胞分裂能力突出引起的“絕對”純度增加和雜細胞數量降低引起的“相對”純度增加。物理方法純化細胞的機制可能是：細胞本身貼壁能力的差異導致直接分離；細胞對物理刺激抵抗能力的差異引起細胞不同程度的繼發凋亡，而凋亡后細胞的貼壁能力降低導致不同程度的間接分離。BMSCs細胞因其相對較強的貼壁能力和抵抗物理刺激的能力，在水平振搖后得到純化。而造血系細胞則因貼壁能力較差在振搖的過程中直接脫壁，或是因其對物理刺激的抵抗能力較弱而產生凋亡后貼壁能力減弱而脫壁。最終達到純化BMSCs的作用。

綜上所述，全骨髓貼壁法提取BMSCs經過水平振搖處理后得到的貼壁細胞，細胞純度得到顯著提升，且由振搖所導致的細胞凋亡較輕，對后續細胞增殖分化能力影響不明顯。因此，相較于現有的提純方法，可更快地獲得高純度、高活性、低分化的間充質干細胞。可以作為治療脊髓損傷，椎間盤退變，纖維環修復的種子細胞，具有更為廣闊的應用前景。

參 考 文 獻

[1] 李洪秋, 王哲, 阿良.骨髓間充質干細胞移植對大鼠脊髓損傷后氧化應激的影響[J].脊柱外科雜志, 2010, 8(3):157-161.

[2] 張憲郁, 徐皓.骨髓間充質干細胞在脊髓損傷治療中的應用[J].脊柱外科雜志, 2006, 4(6):373-376.

[3] Oda Y, Tani K, Isozaki A, et al. Effects of polyethylene glycol administration and bone marrow stromal cell transplantation therapy in spinal cord injury mice[J]. J Vet Med Sci, 2014, 76(3):415-421.

[4] Sakai D, Mochida J, Yamamoto Y, et al.Transplantation of mesenchymal stem cells embedded in Atelocollagen gel to the intervertebral disc: a potential therapeutic model for disc degeneration[J]. Biomaterials, 2003, 24(20):3531-3541.

[5] 李超, 李明.間充質干細胞治療椎間盤退行性變的研究進展[J].脊柱外科雜志, 2012, 10(3):186-189.

[6] Wang LJ, Zhang RP, Li JD.Transplantation of neurotrophin-3-expressing bone mesenchymal stem cells improves recovery in a rat model of spinal cord injury[J]. Acta Neurochir (Wien), 2014, 156(7):1409-1418.

[7] 楊成偉, 鄧國英, 楊洋, 等.單層組織工程纖維環取向納米纖維支架的構建和初步驗證[J].脊柱外科雜志, 2014, 12(2):87-91.

[8] Connelly JT, Vanderploeg EJ, Mouw JK, et al.Tensile loading modulates bone marrow stromal cell differentiation and the development of engineered fibrocartilage constructs[J].Tissue Eng Part A, 2010, 16(6):1913-1923.

[9] Friedenstein AJ, Deriglasova UF, Kulagina NN,et al.Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method[J]. Exp Hematol, 1974, 2(2):83-92.

[10]Dexter TM, Testa NG, Allen TD, et al.Molecular and cell biologic aspects of erythropoiesis in long-term bone marrow cultures[J]. Blood, 1981, 58(4):699-707.

[11]Chen ZZ, Van Bockstaele DR, Buyssens N, et al.Stromal populations and fibrosis in human long-term bone marrow cultures[J]. Leukemia, 1991, 5(9):772-781.

[12]Dezawa M, Kanno H, Hoshino M, et al. Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation[J]. J Clin Invest, 2004, 113(12):1701-1710.

[13]Nadri S, Soleimani M.Isolation murine mesenchymal stem cells by positive selection[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2007, 43(8-9):276-282.

[14]Rouger K, Fornasari B, Armengol V, et al. Progenitor cell isolation from muscle-derived cells based on adhesion properties[J]. J Histochem Cytochem, 2007, 55(6):607-618.

[15]劉文, 王燕, 宋玲, 等. 周期性張應力促進兔髁狀突軟骨細胞的增殖[J]. 中國組織工程研究, 2014, 18(20):3144-3148.

[16]Majd H, Wipff PJ, Buscemi L, et al. A novel method of dynamic culture surface expansion improves mesenchymal stem cell proliferation and phenotype[J]. Stem Cells, 2009, 27(1):200-209.

[17]Engler AJ, Sen S, Sweeney HL, et al. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification[J]Cell, 2006, 126(4):677-689.

[18]徐無忌, 莊洪. 骨康含藥血清對大鼠骨髓間充質干細胞成脂分化的影響[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2008, 12(43):8434-8438.

[19]Giulian D, Baker TJ. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain[J]. J Neurosci, 1986, 6(8):2163-2178.

[20]Feugier P, Black RA, Hunt JA, et al. Attachment, morphology and adherence of human endothelial cells to vascular prosthesis materials under the action of shear stress[J]. Biomaterials, 2005, 26(13):1457-1466.

[21]Liu X, Zhang X, Lee I. A quantitative study on morphological responses of osteoblastic cells to fluid shear stress[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2010, 42(3):195-201.

[22]Chen R, Wang J, Jiang B, et al. Study of cell apoptosis in the hippocampus and thalamencephalon in a ventricular fluid impact model [J]. Exp Ther Med, 2013, 6(6):1463-1468.

(本文編輯于倩)