冷凍技術對精子印記基因DNA 甲基化影響的研究

楊向祎，郭穎，曹小芳，賈艷飛，王曉尉，許劍鋒，周芳，李鴻，梁小薇，盧文紅＊，谷翊群＊

（1.北京協和醫學院研究生院，北京 100730；2.國家衛生計生委男性生殖健康重點實驗室，國家衛生計生委科學技術研究所，北京 100081）

表觀遺傳學是指在細胞核DNA 序列不發生改變的情況下，基因的表型發生穩定的可遺傳的變化。例如DNA 甲基化、組蛋白修飾和染色質重塑，這些修飾可以調節基因轉錄，在胚胎發育及個體成熟過程中起著重要的作用，還可以遺傳給子代［1］。DNA甲基化是表觀遺傳學重要組成部分，指由DNA 甲基轉移酶催化，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶（C）轉變為5-甲基胞嘧啶（5mC），即在CpG二核苷酸內將甲基基團轉移到胞嘧啶的5位碳原子上。我國學者（2013）指出，精子而非卵子的DNA甲基化圖譜可遺傳給子代，子代選擇性地繼承父代而拋棄母代的DNA 甲基化圖譜，并用于指導胚胎早期發育［2］。胚胎早期的DNA 甲基化異常可以導致男性不育及胎兒印記基因缺陷性疾病，如Beckwith-Wiedeman 綜合征、Silver-Russell綜合征，以及Angelman 綜 合 征（Angelman syndrome，AS）／Prader-Willi 綜 合 征 （Prader-Willi syndrome，PWS）。

精子低溫冷凍保存技術已廣泛應用于男性惡性腫瘤放化療前、輸精管絕育術前、輔助生殖技術中的自身精液或精子庫捐精的精子保存［3］。雖然隨著冷凍方法和冷凍保護劑的不斷改良，使精子的存活率有了一定提高，但對精子活力、頂體反應發生率、形態學及授精能力仍然會造成了一些不可逆轉的影響，而對表觀遺傳方面的損傷，至今仍然沒有確切結論。國內外已經大量報道了輔助生殖技術會影響胚胎早期發育，甚至導致子代因表觀遺傳學改變所致的遺傳缺陷，包括較高的生殖功能障礙、腫瘤及印記缺陷性疾病的發生風險等［4］。印記基因DNA 甲基化程度容易受外界環境如溫度［5］、營養供給［6］、重金屬［7］、早期環境刺激［8］和輻射［9］等的影響，從而發生甲基化程度的異常。冷凍技術是否會對精子印記基因DNA 甲基化程度產生影響鮮有報道，本研究旨在對此進行初步探討。

材料與方法

一、樣品采集與分組

1.精液樣品收集：選取10例北京人類精子庫符合捐精條件的正式志愿者為研究對象［10］。經國家衛生計生委科學技術研究所生殖醫學倫理委員會批準及本人知情同意，所取精液全部用于本次實驗。依據第5版《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗手冊》［11］，志愿者禁欲3～5d，手淫法取精，精液完整收集于無菌干燥取精杯中，置37℃水浴中液化

0.5～1h。

2.精液分組：將完全液化的精液樣品平均分為4組：A 組為0.5ml新鮮精液，作為對照；B組0.5ml新鮮精液加入0.5ml冷凍保護劑（自制），37 ℃水浴10min，不冷凍；C 組0.5 ml新鮮精液加入0.5ml冷凍保護劑，冷凍2d；D 組0.5 ml新鮮精液加0.5ml冷凍保護劑，冷凍兩個月。

二、研究方法

1.精液冷凍復蘇：本研究采用精子庫常用的甘油-卵黃-檸檬酸鹽冷凍保護劑（自制）以及液氮程控冷凍降溫法對精子進行冷凍，復蘇時采用37℃水浴快速復溫5～10min［11］。

2.精子DNA 提取：精子DNA 的提取使用微量全基因組DNA 提取試劑盒（Omega，美國），每500μl樣品加用配制的1 mol／L 的DTT 液20μl處理細胞膜。Nano Drop2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）檢測DNA濃度與純度（OD260／OD280），每個樣品分裝3管，標本置于-80℃保存。

3.亞硫酸氫鹽處理：使用亞硫酸氫鹽轉化試劑盒（Qiagen，德國）處理精子DNA，其原理為DNA序列中CpG 島內（5mCG）甲基化胞嘧啶（C）保持不變，未甲基化的胞嘧啶（C）都轉化成尿嘧啶（U），經聚合酶鏈反應（PCR）擴增后，U 轉化為胸腺胞嘧啶（T），分析PCR 產物中C／T 的含量（即C 的比值）可間接定量分析甲基化程度。

4.目的片段擴增：目的區域為H19 印記調控區（imprinting control regions，ICR）（GenBank accession no.AF087017，nucleotides 6 005～6 326），MEST ICR（GenBank accession no.Y10620，nucle-otides 609～898）［12］，PCR 用EX Taq HotStart試劑盒（TaKaRa，日 本），50μl反 應 體 系 為：0.25μl TaKaRa Ex Taq HS、5μl 10×Ex Taq Buffer、4μl dNT PMixture、5μl甲基化后DNA、正反向引物各2.5μl、滅菌蒸餾水30.75μl。反應置于冰上。PCR反應條件列于表1。

5.PCR 產物電泳及純化回收：配置2%的瓊脂糖凝膠，將PCR 產物電泳，通過凝膠成像分析系統，電泳結果見圖1和圖2。使用Easy Pure Quick Gel Extraction Kit瓊脂糖凝膠回收試劑盒（全式金）對凝膠進行目的片段的回收。

表1 引物序列及半巢氏PCR 反應條件

圖1 H19甲基化后DNA PCR 電泳圖

圖2 MEST 甲基化后DNA PCR 電泳圖

6.TA 克隆測序：使用pEASY-T1Cloning Kit試劑盒（全式金），進行目的片段DNA 與質粒的連接。加連接產物于50μl感受態細胞中進行轉化反應，取200μl轉化產物菌液均勻涂于LB 平板上，37 ℃溫箱培養過夜。挑取白色單克隆至10μl無菌水中，取1μl混合液于25μl PCR 體系，用M13通用引物進行菌液PCR 擴增來鑒定陽性克隆，將產物瓊脂糖凝膠電泳。挑選含陽性單克隆菌落的菌液，加入500μl平衡至室溫的液體LB培養基（含Kana抗生素，自制），200r／min，37 ℃培養3h左右。進行基因測序，測序結果用Chromas Lite 軟件（Technelysium Pty Ltd，澳大利亞）打開，結果要求條帶清晰，無套峰等情況。采用BIQ-analyzer甲基化分析軟件（Max Planck Institution，德國）對測序結果進行序列分析及質控。

三、統計學分析

采用SPSS 19.0 統計軟件，Bonferroni法進行多個樣品率的兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、H19甲基化結果分析

1.H19ICR CpG 各位點甲基化狀態分析：統計克隆數，H19總共測試了370個克隆，B、C、D 組的精子其H19ICR DNA 甲基化率以克隆數表示（甲基化克隆數占全部克隆數的百分比）時，與A 組相比，有降低趨勢，但差異無統計學意義（P ＞0.05）。進一步統計CpG 島數，目的片段含21 個CpG 島，H19共測試了7 770個CpG 島，H19ICR DNA 甲基化率以CpG 島數表示（甲基化CpG 島數占全部CpG 島的百分比）時，分別與對照A 組的97.57%相比，差異亦無統計學意義（P＞0.05）。（圖3、表2）。

2.冷凍保護劑對精子H19ICR 的DNA 甲基化程度的影響：H19ICR DNA 甲基化率分別以克隆數和CpG 島數表示時，加冷凍保護劑的B組與未加冷凍保護劑的對照A 組相比，差異均無統計學意義（P＞0.05）。因此，冷凍保護劑對精子H19ICR的DNA 甲基化程度未見影響。（表2）。

3.冷凍過程及冷凍時間對精子H19ICR 的DNA 甲基化程度的影響：H19ICR DNA 甲基化率分別以克隆數和CpG 島數表示時，冷凍的C D 組與未冷凍的B 組相比，有降低趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；冷凍兩個月的D 組與冷凍兩天的C組相比，差異亦無統計學意義（P＞0.05）。因此，冷凍過程及冷凍時間長短對精子H19ICR 的DNA甲基化程度未見影響。（表2）。

二、MEST 甲基化結果分析

1.MEST ICR CpG 各位點甲基化狀態分析：MEST 總 共 測 了295 個 克 隆，B、C、D 組 的 精 子MEST ICR DNA 甲基化率以克隆數表示時與對照A 組相比，有升高趨勢，差異無統計學意義（P＞0.05）。目的片段含有31個CpG 島，MEST 共測試了9 145個CpG 島，MEST ICR DNA 甲基化率以CpG 島數表示時，分別與對照A 組相比，差異亦無統計學意義（P＞0.05）。（表3、圖4）。

圖3 H19ICR CpG 各位點甲基化狀態的點狀圖（BIQ 軟件）

表2 四組H19ICR 甲基化狀態比較［n（%）］

2.冷凍保護劑對精子MEST ICR 的DNA 甲基化程度的影響：MEST DNA 甲基化率分別以克隆數和CpG 島數表示時，加冷凍保護劑的B組與未加冷凍保護劑的對照A 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。因此，冷凍保護劑對精子MEST ICR的DNA 甲基化程度未見影響。（表3）。

3.冷凍及冷凍時間長短對精子MEST ICR 的DNA 甲基化程度的影響：MEST ICR DNA 甲基化率分別以克隆數和CpG 島數表示時，冷凍的C、D組與未冷凍的B 組相比，有降低趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；冷凍2個月的D 組與冷凍2d的C組相比，差異亦無統計學意義（P＞0.05）。因此，冷凍及冷凍時間長短對精子MEST ICR 的DNA 甲基化程度未見影響。（表3）。

圖4 MEST ICR CpG 各位點甲基化狀態的點狀圖（BIQ 軟件）

表3 四組MEST ICR 甲基化狀態比較［n（%）］

討 論

印記基因是指同源基因中只選擇性的表達一方親本基因，另一方則不表達（最常見是由于DNA 甲基化），即呈現為差異性表達［13］。大多數印記基因都是成簇存在，通過不同的ICR 的順式作用來調節其基因的表達或抑制。在許多基因啟動子區，其CpG 二聯核苷的概率高于正常，具有調控作用，被稱為CpG 島。CpG 島的DNA 高甲基化會在空間上阻礙轉錄因子復合物與DNA 鏈結合，抑制基因的表達，這些區域低甲基化能促使基因表達。因此本實驗通過選取印記基因的ICR 區，并對此區甲基化CpG 島進行計數，即可代表整個基因的甲基化程度。

DNA 甲基化印記是周期性動態變化的，受精后胚胎細胞中從親代遺傳來的甲基化標記在去甲基化酶的作用下被擦除，胚胎植入子宮內膜前，新的甲基化標記又在基因組DNA 上重建。與普通基因組DNA 不同，印記基因ICR 區在繼承父母雙方各自的DNA 甲基化印記后，不經歷受精后擦除、重建的過程，能穩定地遺傳下去［14］。一旦受精前精子印記基因DNA 甲基化受外界環境如低溫冷凍的刺激而發生異常，必然會影響到早期胚胎發育甚至子代身體健康。

父源印記基因H19 定位于人染色體11p15.5區，H19ICR 甲基化異常會導致男性不育、胎兒宮內生長受限［15］及子代印記缺陷性疾病的發生［16］。母源印記基因MEST 定位于人類染色體7q31-34，MEST ICR 甲基化異常會導致Silver-Russell綜合癥（SRS）［16］的發生。因此選擇了這兩個分別來自父源和母源的目的基因開展研究。

常用DNA 甲基化分析方法有：甲基化特異性PCR、亞硫酸鹽的限制性內切酶法、亞硫酸鹽氫測序PCR、變性高效液相色譜、焦磷酸測序法、飛行時間質譜平臺、探針和芯片法等。本研究選擇的是亞硫酸氫鹽測序法雖然需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣、昂貴，但可靠性及精確度很高，能明確目的片段中每個CpG 位點的甲基化狀態。

本實驗選取精子庫入選的正式志愿者，無遺傳性疾病家族史，無外傷及性功能障礙史，并進行了染色體核型分析，排除了少、弱精子癥及染色體核型異常等因素的干擾。Collodel等［17］報道，冷凍保護劑會通過氧化應激對精子線粒體等微結構造成損傷。因此，本研究設置了未加保護劑的A 組和加保護劑的B組，本結果顯示，保護劑的使用未對DNA 甲基化造成明顯影響。Flores等［18］報道，冷凍對精子線粒體相關功能及蛋白的損傷是時間依賴性的。因此，本實驗通過對冷凍2d的C 組及冷凍2個月D組的比較，隨著冷凍時間延長，DNA 甲基化程度有增高趨勢，但未見統計學差異。國外學者用焦磷酸測序技術檢測冷凍4周的精子，檢測了9個基因，其結果亦未見影響［19］，本文與其檢測的結果一致。

本實驗研究了冷凍技術、精液冷凍保護劑及冷凍時間對精子DNA 甲基化的影響，雖然統計學上顯示這些因素都未對精子印記基因DNA 甲基化產生影響，但H19DNA 甲基化程度隨著冷凍時間延長有降低趨勢，MEST DNA 甲基化程度隨冷凍時間延長有升高趨勢，且3號志愿者MEST DNA 甲基化出現了異質性，說明冷凍技術可能對某些特定人群DNA 甲基化產生影響。受條件限制，本實驗冷凍時間未達到臨床保存所需的時間要求。在后續實驗中，可通過擴大樣品量、延長冷凍時間及增加候選基因個數，進一步研究與分析個體差異，為精子冷凍保護劑的改良、冷凍保存安全性評估提供參考依據。

致謝：感謝國家衛生計生委科學技術研究所出生缺陷干預實驗室王啟迪、曹小芳、郭昌龍等對本實驗提供的技術支持。

［1］ Beaujean N.Epigenetics，embryo quality and developmental potential［J］.Reprod Fertil Dev，2014，27：53-62.

［2］ Jiang L，Zhang J，Wang JJ，et al.Sperm，but not oocyte，DNA methylome is inherited by zebrafish early embryos［J］.Cell，2013，153：773-784.

［3］ Jensen JR， Morbeck DE，Coddington CC.Fertility preservation［J］.Mayo Clin Proc，2011，86：45-49.

［4］ Talaulikar VS，Arulkumaran S.Reproductive outcomes after assisted conception［J］.Obstet Gynecol Surv，2012，67：566-583.

［5］ Navarro-Martín L，Vi?as J，Ribas L，et al.DNA methylation of the gonadal aromatase（cyp19a）promoter is involved in temperature-dependent sex ratio shifts in the European sea bass［J／OL］.PLoS Genet，2011，7：e1002447.

［6］ Lyko F，Foret S，Kucharski R，et al.The honey bee epigenomes：differential methylation of brain DNA in queens and workers［J／OL］.PLoS Biol，2010，8：e1000506.

［7］ Baccarelli A，Bollati V.Epigenetics and environmental chemicals［J］.Curr Opin Pediatr，2009，21：243-251.

［8］ Beach SRH，Brody GH，Todorov AA，et al.Methylation at SLC6A4is linked to family history of child abuse：an examination of the Iowa Adoptee sample［J］.Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2010，153B：710-713.

［9］ Aypar U，Morgan WF，Baulch JE.Radiation-induced epigenetic alterations after low and high LET irradiations［J］.Mutat Res，2011，707：24-33.

［10］ 中華人民共和國衛生部.人類精子庫基本標準和技術規范［S］.中國生育健康雜志，2004，15：68-71.

［11］ WHO（谷翊群，陳振文，盧文紅，等譯）.世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊［S］.第5版.北京：人民衛生出版社，2010：5-7.

［12］ Poplinski A，Tüttelmann F，Kanber D，et al.Idiopathic male infertility is strongly associated with aberrant methylation of MEST and IGF2／H19ICR1［J］.Int J Androl，2010，33：642-649.

［13］ Koerner MV，Barlow DP.Genomic imprinting-an epigenetic gene-regulatory model［J］.Curr Opin Genet Dev，2010，20：164-170.

［14］ Hiura H，Okae H，Chiba H，et al.Imprinting methylation errors in ART［J］.Reprod Med Biol，2014，13：193-202.

［15］ Turner CL，Mackay DM，Callaway JL，et al.Methylation analysis of 79patients with growth restriction reveals novel patterns of methylation change at imprinted loci［J］.Eur J Hum Genet，2010，18：648-655.

［16］ Azzi S，Abi HW，Netchine I.Beckwith-Wiedemann and Russell-Silver syndromes：from new molecular insights to the comprehension of imprinting regulation［J］.Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2014，21：30-38.

［17］ Collodel G，Federico MG，Geminiani M，et al.Effect of transresveratrol on induced oxidative stress in human sperm and in rat germinal cells［J］.Reprod Toxicol，2011，31：239-246.

［18］ Flores E， Fernandez-Novell JM， Pena A， et al.Cryopreservation-induced alterations in boar spermatozoa mitochondrial function are related to changes in the expression and location of midpiece mitofusin-2 and actin network［J］.Theriogenology，2010，74：354-363.［19］ Klaver R，Bleiziffer A，Redmann K，et al.Routine cryopreservation of spermatozoa is safe--evidence from the DNA methylation pattern of nine spermatozoa genes［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29：943-950.