精子空泡對ICSI患者胚胎發育及臨床結局的影響

孟祥黔，曾泳梅，劉思瑤，黃軍，周建明，鐘影

（四川省成都市錦江區婦幼保健院生殖醫學中心，成都 610016）

不孕不育夫婦中約40%因男方因素所致，其中50%不育男性的精子形態異常，男性不育可能與精子形態異常有關。在形態異常的精子中，精子頭部異常是精子形態異常的主要類型，約占70%［1-3］。其中，精子空泡頭異常比例最高，其次是梨形頭和小頭異常，雙頭和大頭異常的發生率最低。截至目前，研究人員普遍認為精子空泡與精子活力和男性生育能力息息相關，尤其是精子頭部核區域出現的空泡，認為其是男性精子畸形的表現［4］。

自1992年卵胞漿內單精子注射（ICSI）技術誕生以來，傳統的ICSI往往在200～400倍鏡下挑選所謂的“好精子”注射入卵，隨著科學技術的不斷發展，一種新的技術誕生了，即活精子細胞器形態學檢查（MSOME）［5］。該技術是利用高質量的Nomarshi光學系統實時檢查精子動態，通過數字化處理圖像，放大倍數可以超過6 000倍，并經電腦顯示器放大系統選擇形態好的精子。該技術最大的優點就是對活動精子進行實時觀察，且對精子無任何損傷性。相比而言，傳統ICSI對挑選的精子進行評估時具有一定的局限性，僅僅評估頂體和核［6］。而利用精子放大系統則能更好地觀察精子形態，可以清晰地觀察到精子頭部的細微結構。早期對精子細微結構的研究發現，精子核區域常常出現至少1個空泡［7］，只有在高倍鏡下才能發現精子頂體到核區域的空泡［8］。關于精子空泡的起源機制目前仍不明確。有研究認為精子空泡是一種正常的自然現象［8］；亦有研究表明精子空泡起源于精子頂體，同時暗示精子頂體的存在［9］；但其他研究人員對圓頭精子進行觀察時，在精子頭部同樣也發現了空泡，從而提示空泡的起源并非頂體。到目前為止，人類對精子頭部空泡是否導致男性不育及其潛在的其他作用尚不明確。

本研究利用精子MSOME 放大系統對ICSI患者的精子放大6 000倍后進行觀察，并對含有空泡的精子進行拍照，測量空泡直徑及其位置，隨后將不同類別的精子注射入卵并單獨培養，進一步了解精子空泡對胚胎發育、胚胎移植后臨床結局的影響。研究結果報告如下。

資料與方法

一、研究對象

選擇2014年1～11月在我院接受輔助生殖治療的患者57例，其中9例為重復周期。所有患者均由同一位醫生接診治療，均行常規長方案促排卵并常規ICSI助孕治療。

ICSI指征［10］：（1）嚴重少、弱、畸精子癥；（2）不可逆的梗阻性無精子癥；（3）生精功能障礙（遺傳缺陷疾病所致者除外）；（4）男性免疫性不育；（5）體外受精（IVF）失敗；（6）精子頂體異常。

二、研究方法

1.卵母細胞的采集與處理：所有患者均使用常規長方案促排卵：黃體中期予以促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a，達必佳，Ferring，瑞士）0.05mg肌注，14d后予以重組卵泡刺激素（rFSH，果納芬，Merck Serono，德國）150～300U 對卵巢進行刺激，B超監測卵泡生長發育狀況，待卵泡直徑大于18mm后，給予重組人絨毛膜促性腺激素（rHCG，艾澤，Merck Serono，德國）250 mg肌注，36h后在B超介導下經陰道穿刺取卵。將獲得的卵母細胞于透明質酸酶（Hyaluronidase，80 U／ml，Sage，美國）中消化去除顆粒細胞后，置于含Vitrolife序貫培養液（G-IVF，Vitrolife，瑞典）的培養皿中放置37℃、6%CO2的培養箱（Thermo Scientific Forma 3110，美國）培養備用。

2.精子準備：采用梯度離心法洗滌精液，將洗滌好的精液加入精子緩沖液（Spermrinse，Vitrolife，瑞典）中混勻后置于37℃、6%CO2的培養箱中備用。

3.常規ICSI：將處理后的精液吸取少許加入注射皿中的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）里，在200～400倍顯微鏡下挑選形態較好的精子（挑選要求：精子頂體完整、形態正常；精子頭部外部形態完好無損；精子頸部形態正常或頸部液滴較小；精子尾部形態正常且無斷缺；盡量挑選前行精子；如果死精子較多時可選微動精子或尾部彎曲的精子），進行制動（精子制動時，制動位點應在精子尾部靠近精子頭部的1／3處，注射針下壓后橫向快速向右拉動注射針，待看到精子尾部明顯折痕時，表示制動完成），制動1～2次即可，然后放置PVP標記過的位置，之后把準備好的卵母細胞轉入注射皿中的緩沖液滴（G-mops，Vitrolife，瑞典）中，注射時，卵母細胞的極體調整為6點或12點方向進行注射。

4.精子放大系統的使用：在200～400 倍下挑選精子并確定后，注射前利用精子Nomarshi光學系統（OCTAX CytoScreenTM，德國）行MSOME 對精子進行放大觀察，同時對頭部有空泡的精子進行拍照，測量空泡直徑并觀察空泡所在位置。整個實時觀察過程中對精子不造成任何損傷，觀察結束后按照ICSI的常規流程進行注射，注射時按照精子拍照時的順序一一對應地將精子注射入卵母細胞，隨后按照注射順序進行單獨培養，以便觀察精子形態對胚胎發育的影響。

5.胚胎培養及質量評估：顯微注射后的卵母細胞均置于序貫培養液（卵裂期胚胎用G-1 液，囊胚 用G-2 液，Vitrolife，瑞 典）中，在37℃、6%CO2的培養箱中培養。顯微注射16～20h后觀察受精情況，出現兩原核（2PN）為正常受精。采用本實驗室常規評分法對胚胎進行評分，第3 天（D3）胚胎采用WIH 評分法［11］，囊胚采用Gardner評 分 法［12］。

6.胚胎移植與妊娠結果判斷：選擇優質胚胎或囊胚1～2個在B超下進行胚胎移植，移植后4周超聲檢查顯示子宮腔內可見孕囊及胎心搏動者確定為臨床妊娠。

三、統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，實驗結果以百分率（%）表示，采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、精子放大系統下的精子形態

在精子放大系統下對精子行MSOME 觀察精子形態，對頭部有空泡的精子進行拍照（圖1、圖2），測量空泡直徑并觀察空泡所在位置。

二、有無空泡與胚胎發育

觀察空泡精子和無空泡精子注射后胚胎發育的情況，發現兩組的胚胎冷凍率、妊娠率有顯著性差異（P＜0.05），其余各實驗室指標比較均無顯著性差異（P＞0.05），無空泡組的正常受精率和胚胎著床率略高于空泡組，妊娠者中無空泡精子者比例較高（表1）。

二、空泡位置與胚胎發育

圖1 空泡位于頂體＋核位置 ×6 000

圖2 空泡位于精子頂體位置 ×6 000

比較精子頭部空泡的位置與胚胎發育的關系。由于兩組樣本量的原因，因此實驗室各指標均無顯著性差異（P＞0.05）（表2）。

三、空泡直徑與胚胎發育

本次研究中所觀察到的精子空泡直徑均低于2μm。3組不同空泡直徑的精子注射入卵后實驗室各指標比較均無顯著性差異（P＞0.05）（表3）。

表1 空泡精子和無空泡精子注射后各實驗室指標比較［n（%）］

表2 不同空泡位置對胚胎發育的影響［n（%）］

表3 不同空泡直徑對胚胎發育的影響［n（%）］

討 論

關于精子空泡的起源到目前為止仍不明確，因此精子空泡引起了眾多研究者的興趣［13］。精子空泡是否僅出現在不育男性精子中，或者畸形精子癥患者中，或者如少數研究者認為的那樣，精子空泡是一種自然現象？為了解決上述的疑問，Watanabe等［14］于2011年對不同男性精液進行分析，結果顯示，具有生育能力的男性精液中，95.80%的精子頭部含有空泡。其他研究者對不育男性精液的研究發現，在其他指標正常的情況下，精子空泡分別占97.70%［8］和98.40%［15］；不育男性精液指標不正常的 情 況 下，空 泡 精 子 分 別 占98.80%［8］和99.40%［14］。最近，研究者對不育2年以上、接受輔助生殖治療的患者51例和有生育能力者50例的精液進行比較分析，結果發現，精子空泡數量、位置均無顯著性差異［16］。在普遍認為男性精子中有空泡出現的基礎上，人們開始關注精子空泡大小，圍繞“大空泡”（指空泡體積占精子頭部＞4%）展開了一系列研究，并獲得不同結果。較早對ICSI患者的研究表明，“大空泡”在精子中的比例為30% ～40%［11］。Monqaut等［17］研 究 表 明，“大 空 泡”占 不育男性精子比例的61.8%。另外有研究者將“大空泡”定義為空泡占頭部體積的50%，在此基礎上研究大空泡所占比例，結果分別為（25.2±19.2）%［18］或（30.1±17.8）%［19］。上述研究中，精子空泡大小僅僅是依靠操作者的主觀評估。與此同時，研究者對精子空泡進行精確測量得知，有生育能力男性精液中，“大空泡”（指空泡體積占精子頭部＞13%）精子占（9.2±7.2）%，少弱畸精子癥患者中，該類精子占（38±5.1）%［20］。

隨著MSOME 技術與ICSI技術的相互結合，胞漿內選擇性單精子注射（IMSI）技術就此誕生并逐步取得進展。該技術對精子進行實時觀察并放大6 000倍，放大后能觀察到傳統ICSI時400倍鏡下所挑選精子時無法觀察到的細微結構，如精子空泡。同時，精子空泡相關研究也表明，精子空泡與受精低下［21］、低 的 線 粒 體 膜 電 位［22］、高 的 染 色 體 異 常［22］、精子DNA 損傷［23］有關。然而，精子空泡與胚胎發育之間的關系仍不明確。本中心借助精子放大系統對精子拍照并運用軟件測量精子空泡直徑，進一步研究精子空泡對正常受精、D3優胚及可用囊胚的形成以及移植后患者臨床結局的影響。本研究結果表明，無空泡組的正常受精率略高于空泡組（74.1%vs.71.4%），但無統計學差異，這可能與空泡組樣本較少存在一定的偏倚有關；另外，本次研究中所觀察到的精子空泡直徑均低于2μm，可能對正常受精結果并不造成顯著影響。Greco等［24］對男性精子進行分類，第1類（精子頭部形態正常，無空泡或空泡體積＜頭部的4%）和第2類（精子頭部形態正常或頭部最多含2個空泡，一個＜頭部的4%，另一個＞頭部的4%）為第1組，第3類（頭部形態正常伴3個及以上小空泡，空泡體積＜頭部的4%）和第4類（精子頭部形態異常，有大空泡和小空泡）為第2組，兩組的受精率（73.7%vs.66.9%）比較，無顯著性差異。

精子空泡在注射入卵后對患者胚胎發育的影響也引起研究者們的關注。有研究顯示，由于精子的個體形態差異，導致胚胎具有不同的發育潛力，精子頭部無空泡或者少于2個小空泡相比其他形態精子而言，囊胚形成率較高［25］。亦有研究認為精子空泡的存在影響囊胚的形成［26］。2014年，Vingris等［27］對72對行輔助生殖治療夫婦的14 400條精子進行分組分析，研究發現精子空泡數低于2個的精子比例與囊胚形成、胚胎種植率呈正相關，且無空泡的精子流產率較低。

為了能更好地觀察精子空泡對胚胎發育的影響，本研究將精子注射入卵后進行了單獨培養，觀察胚胎發育情況，結果顯示雖然各組間比較無顯著性差異，但無空泡組的可用囊胚形成率和D3 優胚率均高于空泡組，而進一步將空泡精子進行分組后發現，空泡直徑分別為＜1μm、1～1.5μm、＞1.5～2μm的精子注射入卵后，3組的正常受精率、D3優胚率、可用囊胚形成率均無顯著性差異，這一方面可能與本研究所納入的樣本量較少有關，另一方面可能與在低倍鏡下挑選精子時，往往對存在清晰可見的大空泡精子放棄使用，因此本研究所納入的精子空泡直徑均較小有關。Watanabe 等［14］在400 倍下，觀察不育和有生育能力男性的精子形態發現，空泡＞1.5μm 所占比例分別是4.6%和4.2%。有研究顯示，精液指標正常和不正常男性精子空泡大小的平 均 值：前 者 空 泡 平 均 大 小 為1.49 μm［8］，1.8μm［15］；后 者 為1.59μm［8］，1.9μm［15］。Setti等［28］對60 對接受ICSI治療患者的549 枚胚胎進行觀察，結果發現，精子大空泡的出現會影響受精卵的卵裂、D3優胚、囊胚的形成以及形成囊胚的滋養層細胞和內細胞團的細胞數，同時還建議大空泡的體積應該低于精子頭部的24.5%，當大空泡體積低于19.5%時，所形成的囊胚質量較高。2013 年，Knez等［29］在研究中首次運用精子放大系統和胚胎動態觀察系統，發現無空泡精子形成的胚胎卵裂至4細胞和形成囊胚均要早于大空泡精子。

相關研究還顯示，精子空泡的存在不會影響卵母細胞的受精和受精卵的早期卵裂，但是D3 胚胎移植后，患者的臨床結局和活產率有顯著性差異，且IMSI技術的運用能提高臨床妊娠率和胚胎種植率［30-31］。本研究結果顯示，無空泡組與空泡組D3胚胎移植后的著床率（40.3%vs.22.2%）比較無顯著性差異，但臨床妊娠率（77.3%vs.22.7%）比較有顯著性差異，研究結果與前述研究有所不同，可能與樣本量較小、精子空泡直徑均較小有關。本研究中無空泡組的臨床妊娠患者無一例流產，胚胎質量亦相對好于空泡組，這與之前研究報道精子放大系統能有效提高胚胎質量［32］、增加臨床妊娠率［33］、相比傳統ICSI周期更能降低流產率［34-35］的結果相似。

綜上所述，精子頭部空泡直徑低于2μm 時，與無空泡精子相比，兩者注射入卵后，僅胚胎冷凍率和妊娠率有顯著性差異，而胚胎著床率和其余實驗室指標均無顯著性差異。但樣本量較少是本次研究存在的主要問題，后續研究應加大樣本量以驗證精子空泡對胚胎著床率和臨床妊娠率的影響，并做好長期的隨訪工作以觀察妊娠后新生兒的健康狀況，為臨床應用提供一定參考。

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