不同金屬離子在膠原蛋白自聚集過程中的影響研究

邢建宇，白波，李宇亮，宋秀玲

(長安大學 環境科學與工程學院，陜西 西安 710054)

膠原蛋白是生物體主要的結構蛋白，在體外，當溶液環境變化時，可溶性膠原蛋白可發生自組裝聚集作用，進而成纖維化形成膠原纖維。該功能使得膠原蛋白被廣泛的應用于化工、醫藥材料、食品、飼料等領域。天然的膠原蛋白聚集需要的條件，大概為pH 5.0 ～8.5，離子強度在0.1 ～0.8，溫度在15 ～37 ℃［1］。以后的研究表明，pH、溫度、離子強度、離子類型、表面活性劑、糖類以及膠原蛋白非螺旋末端的去除，都對膠原纖維的形成有影響。

功能性材料的研制及其相關機理研究一直都是化學化工專業的熱門領域，但是純化學合成的材料不利于細胞的吸附，缺乏內源性信號。生物材料在合成中應用可以有效的模擬生物環境，但是其位點選擇性修飾比化學方法要復雜，而且機械強度差。將化學合成材料與生物質材料相結合，可兼容有機化合物分子和生物分子的優點，在應用上更有潛力且應用面更廣［2］。在化學合成材料與生物質材料相結合過程中，無機離子及有機分子與膠原蛋白的相互作用無疑起著非常關鍵的基礎作用，對于不同金屬離子對于膠原蛋白的影響，不僅可以在結構上闡述兩者相互作用的方式及機理，研制出更多類型的功能性新材料，如人工骨的合成［3］、微囊材料的研制［4］等。在應用上還會為以膠原蛋白為原料的吸附材料的廣泛應用提供參考，如污染水質中重金屬的去除［5］、以金屬離子為介導的吸附材料的應用［6］等。本文使用不同濃度金屬離子對膠原蛋白的自聚集過程進行了研究，并考察了金屬離子存在時pH 對該過程的影響。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

牛筋，購 自 西 安 市;CuSO4、ZnSO4、K2SO4、Fe2(SO4)3、胃蛋白酶均為分析純。

752 型紫外可見分光光度計;XS-212-201 型生物顯微鏡。

1.2 實驗方法

解凍的牛筋沖洗干凈后，用剪刀剪成小塊，放入體積為牛筋20 倍的0.1 mol/L NaOH 溶液中。在恒溫攪拌器下攪拌4 h 以除去膠原蛋白中的非膠原成分。用清水沖洗牛筋至中性。再將牛筋放入體積為牛筋3 倍的0. 5 mol/L 的醋酸溶液中，以質量比1∶100加入胃蛋白酶，靜置后過濾得膠原蛋白溶液備用。

取膠原蛋白溶液20 mL，用濃度為0.5 mol/L NaOH 溶液調節pH 至5。分裝到4 支試管中。并分別向試管中加入0.5，1.5，2.5 mmol/L 的金屬離子。每隔15 min 用紫外分光光度計測溶液的吸光值。每組實驗做3 次，取平均值。取膠原蛋白溶液15 mL，分別以每試管5 mL 的量加入3 支試管，調節其pH 分別為3. 0，5. 0，7. 0，再向每支試管加入1.5 mmol/L的金屬離子溶液。每隔15 min 用紫外分光光度計測溶液的吸光值。每組實驗做3 次，取平均值。

2 結果與討論

2.1 金屬離子與膠原蛋白的相互作用

在不同的pH 下，金屬離子與膠原蛋白的相互作用可能會引起不同的聚集狀態。由于金屬離子的溶解性受pH 影響，所以在特定的pH 條件下，金屬離子溶解性會降低并析出。而膠原蛋白在pH 升高的過程中，也會發生自聚集作用，形成膠原纖維。所以研究不同金屬離子與膠原蛋白的相互作用時，在pH 影響下的析出過程，會有以金屬離子引起膠原變性產生的沉淀以及金屬離子輔助膠原蛋白自聚集產生纖維兩種情況。膠原蛋白聚集體示意圖，見圖1。

圖1 膠原蛋白聚集體示意圖Fig.1 Picture of collagen aggregates

圖1A 中，不含有金屬離子的膠原蛋白溶液在合適的pH 環境條件下，不需添加任何試劑，可自發進行側鏈的相互作用，進而形成膠原纖維。圖1B，不同的金屬離子可在不同程度上加快或者抑制這一過程。但是所產生的聚集體主要還是以纖維狀為主。圖1C 當金屬離子含量較高時，pH 引起金屬離子溶解性的變化，此時膠原蛋白容易發生變性，形成無規則的卷曲，所形成的沉淀聚集，并非以纖維狀存在，而是以粒狀沉淀為主。

2.2 不同金屬離子對膠原蛋白自聚集過程的影響

膠原蛋白在酸性條件下可溶，其自聚集過程的發生，隨著pH 的升高，而速率加快。為了考察金屬離子對于這種自聚集析出過程的影響，特選擇pH 5.0作為考察金屬離子影響的最適pH，膠原蛋白濃度選擇1 mg/mL。由于不同陰離子對于膠原蛋白的自聚集作用也有著顯著的影響［7］，故所選擇的陰離子均為硫酸鹽，在同樣的陰離子存在狀態下，對不同的金屬離子的影響進行考察。

Cu2+對膠原蛋白自聚集過程的影響見圖2A。當不存在Cu2+時，膠原蛋白會發生緩慢的自聚集作用，而隨著Cu2+的加入，自聚集作用迅速提高，且隨著Cu2+的增加，自聚集的速度也更快。但是當Cu2+為2.5 mmol/L 時，膠原蛋白溶液的濁度先增加后減小。可能是因為Cu2+與膠原蛋白側鏈的相互作用是以螯合形式發生的，該種螯合作用有利于側鏈之間的聚集，而當金屬離子含量增高時，金屬離子正電荷之間的互相排斥，而不利于膠原蛋白的聚集。由圖2B 和表1 可知，Zn2+對于膠原蛋白自聚集過程的影響比較小，不含Zn2+時，斜率約為0. 15 ×10－3，隨著Zn2+的添加，斜率略有升高，變為0.25 ×10－3。當Zn2+濃度為1. 5 mmol/L 時，斜率降為0.13 ×10－3。當Zn2+濃度為2.5 mmol/L 時，斜率降為0.1 ×10－3。說明在0 ～2.5 mmol/L 的濃度范圍內，Zn2+在低濃度時有助于膠原蛋白的自聚集，但是隨著濃度的升高，而出現抑制作用。由表1 可知，當硫酸鐵的含量為0，0.5，1.5，2.5 mmol/L 時，所對應的膠原自聚集曲線的斜率分別為0. 16 ×10－3，1.27 ×10－3，2.2 ×10－3，3.24 ×10－3。在0 ～2.5 mmol/L 的濃度范圍內，呈依次增大的趨勢且并沒有出現抑制的現象。K+的加入會引起膠原蛋白自聚集速率的降低。由圖2D 及表1 可知，在0 ～2.5 mmol/L的濃度范圍，K+的存在增加了膠原蛋白分子表面的電荷，增強了其與水分子的相互作用，使膠原蛋白的溶解性增大。

圖2 pH 5.0 時不同金屬離子對膠原蛋白自聚集過程的影響Fig.2 Effect of different metal ions on self-aggregation processes of collagen with pH 5.0

表1 不同金屬離子對于膠原自聚集產生的濁度變化速率的影響Table 1 Effect of different metal ions on turbidity change rate produced by collagen self aggregation

根據柯林斯理論［8］，將離子都近似看作為中心處帶有一個點電荷的殼球，當離子半徑較小時，周圍的水合離子就會與之緊密結合;反之，當離子半徑較大時，周圍的水合離子與它的結合作用就較弱。Cu2+、Zn2+、Fe3+、K+的離子半徑分別為0. 073，0.074，0.055，0.138 nm。其中K+的離子半徑大于其他3 個離子，所以K+與膠原分子的相互作用力弱于其他3 個離子。而離子半徑最小的Fe3+由于能與周圍水合離子緊密結合，所以比Zn2+具有更強的結合能力，在引起膠原蛋白自聚集時作用更加明顯。Cu2+和Zn2+具有相同的離子半徑，但是Cu2+具有更強的促膠原自聚集作用。這可能與Cu2+在溶液中的存在狀態有關，Cu2+在水溶液中實際上是以水合離子［Cu(H2O)4］2+的形式存在的，該種水合狀態更加有利于Cu2+吸附到膠原蛋白表面。所以Cu2+在金屬離子中與膠原蛋白的結合能力最強，很多膠原蛋白吸附材料的制備都表現出對Cu2+強的吸附能力。

2.3 不同金屬離子存在的條件下pH 對膠原自聚集過程的影響

使用濃度較低的膠原蛋白溶液(0.3 mg/mL)，分別選取了pH 3.0，5.0，7.0 作為測試Cu2+、Zn2+、Fe3+的pH 條件，根據不同濃度金屬離子對膠原蛋白聚集過程的影響，Cu2+、Zn2+、Fe3+的濃度分別選擇為1.5，2.5，1.5 mmol/L，結果見圖3。

圖3 不同pH 下Cu2+、Zn2+、Fe3+對膠原蛋白聚集過程的影響Fig.3 Effect of Cu2+，Zn2+ and Fe3+ on collagen aggregation process with different pH

由于常溫下Cu2+可在pH 5.2 ～6.4 形成沉淀。所以由圖3A 可知，不同的pH 條件對于Cu2+促膠原蛋白共聚集的影響并不是很大，Cu2+在pH 為5.0時，對膠原共聚集作用影響最大。相對于Cu2+而言，Zn2+在pH 7.0 左右會形成沉淀，所以Zn2+的溶解性有著更加寬泛的pH 范圍。由圖3B 可知，pH的改變對于Zn2+促膠原蛋白聚集過程的影響較大，pH 為3.0 時，膠原蛋白的聚集作用并不明顯，當pH為5.0 時，在45 ～60 min 有較大的濁度變化，預示著聚集作用的發生。當pH 為7.0 時，膠原蛋白的聚集作用發生的時間被縮短，在30 min 時濁度達到平衡。Fe3+存在的條件下，不同pH 對于膠原蛋白自聚集作用的影響見圖3C。當pH 為3.0 和5.0時，膠原蛋白溶液的濁度變化并不大，但是當pH 為7.0 時，濁度發生很大的改變，此時膠原蛋白的聚集，可能不再是金屬離子輔助的膠原蛋白有規律的成纖維狀態，而是以Fe3+析出為主的相變過程，在此過程中膠原蛋白以無規則狀態伴隨著Fe3+的析出而析出。由以上不同的金屬離子的分析可知，因為pH 對于金屬離子的存在狀態以及對于膠原蛋白的自聚集作用都有較大的影響，且不同金屬離子的溶解性具有不同的pH 范圍。所以不同的金屬離子在膠原自聚集過程中的影響更加復雜。

3 結論

考察了不同的金屬離子對于膠原蛋白自聚集過程的影響，在與膠原蛋白的相互作用方面，基本符合柯林斯理論，大小順序為Cu2+＞Fe3+＞Zn2+＞K+。另外，對于金屬離子存在條件下，pH 對于膠原蛋白自聚集的影響研究發現，Cu2+存在時，pH 的影響并不大，而Zn2+存在時影響較大。Fe3+在輔助膠原成纖維方面影響不大，且溶解性受pH 影響更大。

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