產(chǎn)高酸黑曲霉菌株篩選及生產(chǎn)應(yīng)用

高志林 (安徽豐原馬鞍山生物化學(xué)有限公司，安徽馬鞍山243051)

檸檬酸具有令人愉悅的酸味，入口爽快，無后酸味，安全無毒，廣泛用作食品和飲料的酸味劑。檸檬酸工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)主要有表面(淺盤)發(fā)酵法、深層液體發(fā)酵法和固體發(fā)酵法［1］。隨著我國(guó)選育的耐高糖、耐高檸檬酸并具有抗金屬離子的黑曲霉高產(chǎn)檸檬酸菌株被成功應(yīng)用于深層液體發(fā)酵，目前國(guó)內(nèi)檸檬酸發(fā)酵主要方式是深層檸檬酸發(fā)酵。經(jīng)過多年發(fā)展，國(guó)內(nèi)檸檬酸發(fā)酵及提取技術(shù)趨于成熟，但受環(huán)保政策及銷售市場(chǎng)因素的影響，檸檬酸制造企業(yè)遇到新的挑戰(zhàn)。

2013年我國(guó)檸檬酸(鹽)產(chǎn)能達(dá)170萬t，創(chuàng)歷史新高，占世界產(chǎn)能的80%，但全球檸檬酸需求量?jī)H有150萬～160萬t，全球產(chǎn)能過剩70萬t，國(guó)內(nèi)檸檬酸產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益呈下滑趨勢(shì)［2］，而玉米、煤炭、硫酸等主要輔料價(jià)格上升。因此，要趕超國(guó)內(nèi)檸檬酸生產(chǎn)標(biāo)桿水平，開拓新的國(guó)際市場(chǎng)，就必須進(jìn)行技術(shù)創(chuàng)新，提高發(fā)酵水平和下游提取效率。

檸檬酸菌種的優(yōu)劣對(duì)于檸檬酸產(chǎn)率和生產(chǎn)成本具有重要作用，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵，降低成本，檸檬酸菌種的馴化和選育是關(guān)鍵［3］。自我國(guó)生產(chǎn)檸檬酸以來，天津工藝微生物研究所、上海工業(yè)微生物研究所不斷推出適合不同原料的高產(chǎn)菌株，使?jié)饬细甙l(fā)酵指數(shù)的深沉發(fā)酵工藝不斷完善［4］。張洪勛［5］等統(tǒng)計(jì)表明，自2008年來，我國(guó)檸檬酸生產(chǎn)水平大幅提升，糧耗、成品收率及能源消耗等技術(shù)指標(biāo)已優(yōu)于美國(guó)、西歐等同類企業(yè)的技術(shù)水平，達(dá)到世界先進(jìn)行列。馮和志等調(diào)研表明，2012年檸檬酸行業(yè)發(fā)酵單罐產(chǎn)酸平均約為14.69%，發(fā)酵指數(shù)約為1.67，具有較大上升空間。隨著時(shí)間的推移，檸檬酸行業(yè)內(nèi)部分企業(yè)通過對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)過程的優(yōu)化，目前宜興協(xié)聯(lián)公司發(fā)酵水平最優(yōu)，其平均單罐產(chǎn)酸達(dá)15.89%，發(fā)酵糧耗約為1.562 t/t(該數(shù)據(jù)由國(guó)家發(fā)酵行業(yè)協(xié)會(huì)提供)。筆者為降低生產(chǎn)成本，采用選擇性條件進(jìn)一步對(duì)黑曲霉菌株CO827進(jìn)行馴化、篩選，將得到的高效率黑曲霉菌株用于實(shí)際生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 材料:CO827菌株(安徽豐原馬鞍山生物化學(xué)有限公司)，檸檬酸成品(安徽豐原馬鞍山生物化學(xué)有限公司)，耐高溫a－淀粉酶(諾維信公司)，瓊脂、麩皮、糖液(安徽豐原馬鞍山生物化學(xué)有限公司一車間)，麥芽、土豆、尿素、發(fā)酵底料(安徽豐原馬鞍山生物化學(xué)有限公司一車間)，斐林試劑。

儀器:智能霉菌培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)，臥式壓力蒸汽滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)，搖瓶培養(yǎng)箱，無菌操作室等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制。

1.2.1.1 梯度酸性培養(yǎng)基。4.5 Be麥芽汁200 ml，瓊脂 4 ～6 g;稱取檸檬酸 20、30 g，分別于 0.15 MPa滅菌 30 min。冷卻至45～55℃，混勻后做成酸度分別為10%、15%的酸性平板［6］。

1.2.1.2 搖瓶培養(yǎng)基。取玉米粉250 g，加水定容至1 000 ml后，添加2 ml α-淀粉酶，加熱至90℃后保溫液化30 min，取其中90%混合物過濾所得清液與剩余的10%混合液混合(模擬生產(chǎn)發(fā)酵實(shí)際情況)，以50 ml/瓶進(jìn)行分裝滅菌。

1.2.1.3 麩曲培養(yǎng)基。麥麩皮過篩去除細(xì)粉，用水洗至水清為止，用手?jǐn)Q至有水出而不滴水為止，以60 g/瓶進(jìn)行分裝，于0.10 MPa滅菌30 min。

1.2.2 糖度測(cè)定。吸取10 ml試樣于250 ml錐形瓶中，加入50 ml蒸餾水，7.5 ml濃H2SO4，裝上空氣或水冷凝回流管，加熱至沸，保持5 min，急速冷卻。冷卻后用30% ～40%NaOH溶液中和至pH 7.0～8.0，定容至500 ml，搖勻。取費(fèi)林甲乙液各5 ml于50 ml錐形瓶中，加樣溶液2 ml于錐形瓶中，加適量0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，控制瓶中液體在2 min內(nèi)沸騰，并保持微沸，然后以2～3 s/滴的速度滴至藍(lán)色消失，記錄葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的體積。總糖計(jì)算公式［7］:總糖(%)=(V1－V0)×2.5，式中，V0為空白體積，V1為檢測(cè)樣體積。

1.2.3 檸檬酸酸度測(cè)定。取酸解液1 ml于150 ml錐形中，加適量蒸餾水，加濃度0.5%酚酞指示劑1～2滴，用0.142 9 mol/L NaOH溶液滴定至粉紅色，所用氫氧化鈉的體積(ml)即為樣品酸度［8］。

1.2.4 產(chǎn)高酸黑曲霉篩選。將黑曲霉CO827菌株，接種于酸度10%的酸性平板中，在34～35℃的培養(yǎng)間中培養(yǎng)3 d，挑選生長(zhǎng)優(yōu)良的單菌落接種于斜面試管中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后對(duì)選出的7個(gè)菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為34℃，搖床轉(zhuǎn)速為250 r/min)，經(jīng)培養(yǎng)72 h后測(cè)定酸度，選取轉(zhuǎn)化率高的菌株作為復(fù)篩菌株。然后用同樣方法將所得復(fù)篩菌株再進(jìn)行酸度15%酸性平板和搖瓶培養(yǎng)，最終得到CO827-0515-7菌株為最佳產(chǎn)酸菌株。

1.2.5 黑曲霉CO827-0515-7菌株與原黑曲霉C0827菌株成本對(duì)比。將CO827-0515-7菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并接入麩曲中用于安徽豐原馬鞍山生物化學(xué)有限公司生產(chǎn)，通過統(tǒng)計(jì)發(fā)酵運(yùn)行數(shù)據(jù)，將其與原黑曲霉CO827菌株進(jìn)行生產(chǎn)成本對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果 用酸度10%平板篩選所得7個(gè)菌株，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)測(cè)定48、72 h產(chǎn)酸情況，結(jié)果見表1。

表1 搖瓶初篩試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，所得7個(gè)初篩菌株在48 h的鏡檢形態(tài)基本相同，但7號(hào)菌株48、72 h產(chǎn)酸優(yōu)于其他組別及對(duì)照組，因此選用7號(hào)菌株進(jìn)行下一步的復(fù)篩試驗(yàn)。

2.2 復(fù)篩結(jié)果 用酸度15%平板對(duì)7號(hào)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，選取平板中單菌落再進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定48、72 h產(chǎn)酸情況，結(jié)果見表2。

由表2可知，試驗(yàn)組產(chǎn)酸效果均優(yōu)于對(duì)照組，其中序號(hào)為0515-2和0515-7號(hào)菌株產(chǎn)酸效果最好。對(duì)比2菌株的48 h鏡檢結(jié)果可知，0512-2菌株的菌絲偏長(zhǎng)，考慮其在大生產(chǎn)過程中，可能被具有剪切力的攪拌破碎較為嚴(yán)重，影響發(fā)酵罐溶氧效果，故選擇48h鏡檢菌絲較短的0515-7號(hào)菌株作為下一步篩選的菌株。

表2 搖瓶復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果

2.3 復(fù)篩菌株產(chǎn)酸效果驗(yàn)證 對(duì)選定的0515-7號(hào)菌株通過增設(shè)平行組，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定48、72 h產(chǎn)酸情況，結(jié)果見表3。

表3 產(chǎn)酸效果驗(yàn)證

由表3可知，0515-7號(hào)菌株產(chǎn)酸效果穩(wěn)定，且轉(zhuǎn)化率較高于對(duì)照組。

2.4 生產(chǎn)成本分析 將CO827-0515-7菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并通過接種麩曲運(yùn)用于該公司生產(chǎn)中，結(jié)果表明，使用CO827-0515-7號(hào)菌株后，發(fā)酵糧耗為1.561 t/t，與國(guó)內(nèi)發(fā)酵水平最優(yōu)的宜興協(xié)聯(lián)公司基本持平(1.562 t/t)，發(fā)酵生產(chǎn)成本降低了82.95元/t。因目前馬鞍山公司自發(fā)酵壓濾后，產(chǎn)品收率約為92.3%，故折合檸檬酸成品總成本下降了76.60元/t，若以馬鞍山公司5.22萬t/年產(chǎn)量計(jì)算，則可減少總成本約合400萬元(表4)。

表4 生產(chǎn)成本分析

3 結(jié)論

該研究通過梯度酸式平板篩選出具有高產(chǎn)酸、高糖酸轉(zhuǎn)化率等特點(diǎn)的CO827-0515-7號(hào)菌株，并成功運(yùn)用于生產(chǎn)過程中，在未改變檸檬酸產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量和固有風(fēng)味的基礎(chǔ)上，降低發(fā)酵生產(chǎn)成本約82.95元/t(清液)，折合檸檬酸成品總成本下降了76.60元/t，僅馬鞍山公司每年度可降低成本400萬元。產(chǎn)高酸黑曲霉菌株CO827-0515-7篩選及生產(chǎn)應(yīng)用，代表了生物發(fā)酵技術(shù)的一種創(chuàng)新，使安徽豐原馬鞍山公司的發(fā)酵技術(shù)水平在國(guó)內(nèi)處于領(lǐng)先地位。

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