pcDNA3.1-GFP-LC3B真核表達載體的構建

劉宣宣，王文倩，毛偉平 ，嚴 浩，孟素芳，王 芳

(1.南京醫科大學康達學院生理學教研室，江蘇連云港222000;2.南京師范大學江蘇省分子醫學實驗室，江蘇南京210023)

LC3為微管相關蛋白1輕鏈3，是酵母 Atg8的同源體［1］。LC3包括 LC3-I和LC3-II，前者是可溶性的，后者結合于自噬結構膜上。Kabeya等［2］發現，LC3-II在自噬體和自噬前體的內外膜特異表達，且LC3-II的表達與自噬結構的形成成正比，因此常用GFP-LC3作為自噬體的標志物，觀察活細胞的自噬活動［3］。哺乳動物自噬蛋白LC3常作為自噬體的標記，在4種 LC3同源異構體中，LC3B最常被用作標記物［4］，因此，筆者對含 GFP-LC3B基因的真核表達載體的構建進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑。逆轉錄酶mlV、質粒小提試劑盒、DNA膠純化試劑盒、隨機引物(TaKaRa公司)，磷酸鈣轉染試劑盒(碧云天公司)。

1.1.2 主要儀器。PE-480型 DNA擴增儀 PCR儀(PE公司)，凝膠圖像分析儀(Vilberlourmat公司)，AB1310全自動DNA測序儀(Perkin-Elmer公司)，Hera Cell 150 CO2細胞培養箱(Heraeus公司)。

1.1.3 試驗材料。HEK293細胞、WRL68細胞、宿主菌 DH 5α均由南京師范大學江蘇省分子醫學實驗室保存，pcDNA3.1-GFP載體質粒由南京醫科大學饋贈。

1.2 方法

1.2.1 LC3B基因模板的獲得。Trizol法提取 HEK293細胞內總RNA，mRNA逆轉錄合成cDNA，PCR反應條件:各引物終濃度 0.1 μmol/L，dNTP 各 50 μmol/L，Taq 酶 2 μl，MgCl2115 mmol/L，合計50 μl。PCR擴增程序:94℃預變性5 min;94℃ 變性45 s，56℃ 退火45 s，72℃ 延伸1 min，30個循環;最后72℃ 延伸10 min。PCR產物放入 －20℃ 冰箱備用。

1.2.2 LC3B基因引物設計。使用 Primer軟件，根據 Gen Bank公布的人源LC3B基因序列設計引物，兩端分別引入BamH I和EcoR I酶切位點，并在 BamH I酶切位點后加入Kozak序列。P1上游引物:5'-CGC GGATCC GCCACC ATGCCGTCGGAGAAGACC-3'BamH I;下游引物:5'-CCG GAATTC TTACACTGACAATTTCAT-3'EcoR I。該引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2.3 LC3B 基因的擴增和獲得。PCR 反應體系(50 μl):P1(20 μmol/L)1 μl，P2(20 μmol/L)1 μl，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4 μl，10 × PCR Buffer 5 μl，模板 cDNA 1 μl，MgCl2(25 mmol/L)3 μl，Taq 酶 0.25 μl，dd H2O 4.75 μl。PCR 反應條件:95℃ 預變性5 min;95℃ 變性30 s，56℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min;30個循環，最后72℃延伸7 min。對PCR產物進行1.5%Agarose電泳鑒定，紫外燈下觀察拍照。

1.2.4 LC3B基因PCR產物純化。回收目的基因，在紫外燈下切下目的條帶，加入DR-I Buffer，均勻混合后75℃ 加熱融化膠塊 6～10 min，加入 1/2 DR-I Buffer體積的 DR-II Buffer，均勻混合。將上清液轉移至 Spin Column中，12 000 r/min離心 1 min，棄濾液。加入 500 μl Rinse A，12 000 r/min離心 30 s，棄濾液。加入 700 μl Rinse B，12 000 r/min 離心30 s，棄濾液，重復1次。將 Spin Column安置于新的1.5 ml EP管中，加入 25 μl滅菌水(加熱到 60℃)，室溫靜置1 min。12 000 r/min離心1 min，洗脫DNA。純化目的片段，進行1.5%Agarose電泳鑒定。

1.2.5 基因與 T載體連接并測序。按照 pMD19-T載體試劑盒說明進行。取2 μl純化后的 DNA產物與 pMD19-T載體和雙蒸水共5 μl，加入等量 Solution I，16℃ 連接 1 h，取連接混合物10 μl加入到100 μl感受態細胞液中，冰浴30 min后42℃ 水浴熱激90 s，立即置冰上，冰浴5 min;每管加入800 μl經37℃ 預熱的 LB液體培養基，37℃ 220 r/min振蕩培養1 h，12 000 r/min離心3 min，棄部分上清，留約200 μl菌液重懸后涂布于含50 μg/ml Kan+的LB固體培養基平板上，37℃正置1 h后，倒置培養過夜。挑選白色克隆株進行菌落PCR鑒定，菌液送上海華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.6 質粒 pcDNA3.1-GFP的提取。質粒提取按照 Plasmid Miniprep Kit操作指南進行。提取后－20℃ 冰箱保存備用。所得質粒進行1.5%Agarose電泳鑒定。

1.2.7 目的基因與載體雙酶切。LC3B目的基因和提取的pcDNA3.1-GFP質粒分別用限制性內切酶 BamH I和EcoR I進行雙酶切。酶切體系:dd H2O 6 μl，10 × Buffer 2 μl，樣品10 μl，BamH I 1 μl，共 20 μl。酶切反應條件:37 ℃，7 h。酶切過后，每管加入6 × Loading Buffer 5 μl終止反應，后用1.5%Agarose電泳分離酶切基因與載體，把酶切好的目的基因與載體用DNA凝膠回收試劑盒割膠回收。

1.2.8 目的基因與載體連接。將酶切后的LC3B片段和質粒經割膠純化后，用T4DNA連接酶連接。連接反應體系為(10 μl):dd H2O 3 μl，10 × T4Ligase Buffer 1 μl，LC3B 基因3 μl，pcDNA3.1-GFP 載體 2 μl，10 × T4Ligase 1 μl。連接反應條件為:16℃ 水浴，過夜連接14～16 h。

1.2.9 連接產物的轉化。取20 μl連接產物與200 μl制備好的感受態細胞混合均勻，冰浴40 min;42℃ 水浴熱激90 s，立即置冰上，冰浴5 min;每管加入800 μl經37℃預熱的LB液體培養基，37℃、220 r/min振蕩培養1 h，12 000 r/min離心3 min，棄部分上清，留約200 μl菌液重懸后涂布于50 μg/ml Kan+的LB固體培養基平板上，37℃正置1 h后，倒置培養過夜。

1.2.10 陽性克隆的篩選與鑒定。

1.2.10.1 菌落PCR鑒定陽性克隆。隨機挑取單克隆菌落至含 50 μg/ml Kan+的 3 ml LB 液中，37℃、220 r/min振蕩培養過夜。取2 μl菌落進行PCR鑒定，PCR體系與條件同“1.2.3”。PCR 產物用1.5%Agarose 電泳鑒定，紫外燈下觀察拍照。

1.2.10.2 雙酶切鑒定陽性克隆。提取質粒，用 BamH I和EcoR I進行雙酶切鑒定，酶切體系與條件同“1.2.7”。酶切產物用1.5%Agarose電泳鑒定，紫外燈下觀察拍照。

1.2.11 DNA測序。用 pcDNA3.1質粒的通用引物進行基因測序，進一步確認質粒構建是否成功。

1.2.12 重組質粒轉染細胞檢測自噬。按照磷酸鈣轉染試劑盒說明進行，將重組質粒轉入HEK293細胞中，在熒光顯微鏡下觀察轉染基因的表達。

2 結果與分析

2.1 目的基因擴增結果 LC3B基因是以從HEK293細胞中提取RNA經反轉錄得到的cDNA為模板，通過引物擴增出的，條帶大小約為378 bp(圖1)。條帶1 PCR擴增結果背景清晰，條帶單一明亮，可基本確定所擴增片段為基因片段LC3B。

2.2 菌落擴增結果 以菌落為模板，通過引物擴增出LC3B基因，大小約為 378 bp(圖2)。條帶 2、3擴增結果背景清晰，條帶單一明亮，可以基本確定該菌落為陽性克隆菌。

2.3 雙酶切鑒定結果 以酶切位點BamH I和EcoR I進行雙酶切鑒定后(圖3)，pcDNA3.1-GFP-LC3B雙酶切后有2條帶，上面的條帶大小與條帶2大小相似，且略小，下面的條帶大小約為378 bp，由此可推斷LC3B基因成功插入雙酶切后的 pcDNA3.1-GFP(約 6 170 bp)載體中，即 pcDNA3.1-GFPLC3B重組質粒構建成功。

2.4 pcDNA3.1-GFP-LC3B載體測序結果 將構建成功的pcDNA3.1-GFP-LC3B菌液進行DNA測序，進一步鑒定質粒構建是否成功。測序結果顯示，正反兩向引物所擴增出的基因序列與從數據庫提取的序列相同，所以確定pcDNA3.1-GFP-LC3B構建成功。

2.5 GFP-LC3B質粒在HEK293細胞中的表達情況 將GFP-LC3B質粒經磷酸鈣轉染法轉染至HEK293細胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察(圖4)，由于重組質粒帶有GFP基因，在細胞未發生自噬時，LC3B表現為LC3B-I，均勻分布于細胞質中，故轉染GFP-LC3B質粒的HEK293細胞中很明顯出現均勻的綠色熒光，證明重組質粒GFP-LC3B轉染成功。

2.6 鎘誘導HEK293細胞和WRL68細胞的自噬情況 成功轉染GFP-LC3B質粒后的HEK293細胞和WRL68細胞，以10 μmol/L CdCl2誘導處理8 h后，兩細胞均出現了不同程度的綠色點狀聚集現象，即未發生自噬時均勻分布于細胞中的 LC3B-I(18 kDa)在 CdCl2的誘導下向 LC3B-II(16 kDa)轉變，即GFP-LC3BI向 GFP-LC3BII轉化，而LC3B-II一般只出現在自噬體膜或溶酶體膜上，從而形成集中于自噬體膜或溶酶體膜上的綠色熒光點狀聚集。Dong等［5］發現低濃度鎘離子(＜10 μmol/L)可以抑制因缺乏小牛血清與堿性成纖維細胞生長因子而引起的細胞自噬。此細胞試驗再次證明pcDNA3.1-GFP-LC3B重組質粒構建成功。

3 討論

自噬基因LC3B有I型和II型之分。細胞未發生自噬時，細胞內合成的 LC3B經過加工，成為胞漿可溶性的 I型LC3B，當自噬發生時，I型 LC3B經泛素樣加工修飾過程，LC3-I與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結合，形成II型LC3B。LC3B-II結合在胞內自噬體的膜上，LC3B-II含量的多少與自噬泡數量成正比［6－7］。因此LC3B的表達量與自噬程度密切相關。

該試驗以Gene Bank公布的人源LC3B的cDNA序列為依據，在起始密碼子AUG及終止密碼子處設計引物，并在5'端和3'端分別引入 BamH I和 EcoR I酶切位點，BamH I和EcoR I在LC3B基因序列中不存在，但在pcDNA3.1-GFP質粒的多克隆位點處存在，同時在目的基因的5'端ATG前面引入Kozak序列GCCACC后，有助于提高基因的轉錄和翻譯效率。

構建克隆載體時選擇T載體，利用T-A克隆，無需使用含限制酶序列的引物，無需優化PCR產物，不需做平端處理及添加接頭即可直接進行基因克隆，操作方便，成功率高。Xu 等［8］、Lu 等［9］在克隆、測序目的基因時都采用 T-A 克隆。

該研究采用pcDNA3.1-GFP質粒，原因是GFP具有以下優點:①個GFP個基因片段長度較小(約717 bp)，易于構建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發活性，可在多種異源生物中表達且無細胞毒性，蛋白本身性質穩定。在熒光顯微鏡下，用波長約490 nm的紫外光激發后，即可觀察到綠色熒光，直接、簡捷、便于檢測;在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，說明GFP-LC3B融合蛋白在細胞內表達成功。②無需任何作用底物或共作用物，檢測的靈敏度不受反應效率的影響，保證了極高的檢測率［10］。

在熒光顯微鏡下觀察到GFP-LC3B會彌散性分布在胞漿內，當細胞自噬時，GFP-LC3B-II表達在自噬體膜或溶酶體膜上使細胞呈現綠色熒光點狀聚集，為細胞自噬提供依據。因此，pcDNA3.1-GFP-LC3B重組質粒的成功構建為今后研究細胞自噬提供了一定基礎。

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