胰蛋白酶基因的系統發育分析

王亞云，趙力，譚婷婷，徐麗，王家林(青島科技大學生物系，山東青島266042)

胰蛋白酶是消化酶的一種，它作為絲氨酸蛋白酶家族中的成員廣泛存在于生物有機體中［1］。絲氨酸蛋白酶家族包括多種形式的酶類，如胰腺蛋白消化酶﹑凝血系統中的肝臟蛋白酶等。其中胰蛋白酶屬于胰腺蛋白消化酶的一種。在胰臟中其最初分泌物為胰蛋白酶原，經降解而成為具有活性的酶。另外，絲氨酸蛋白酶原為了避免在體內細胞中自溶，在氨基末端區域會轉化為不含信號序列的酶原［2］。胰蛋白酶是肽鏈內切酶，其作用部位是賴氨酸或精氨酸羧基端的肽鍵，所以由賴氨酸或精氨酸的羧基所構成的肽鏈均能被胰蛋白酶選擇性地水解［3］。胰蛋白酶能消化溶解變性蛋白質，促進肉芽組織新生，常用于動物細胞培養前對組織的處理［4］，其作用機理是胰蛋白酶水解細胞間的蛋白質，從而使細胞離散。另外，絲氨酸家族的蛋白酶還能參與一些生理過程的反應，如免疫防御反應、神經系統的調制和產卵行為反應［5－10］。

目前，關于胰蛋白酶分子量的研究較多。如哺乳動物中牛胰蛋白酶分子量為23.3 kD，豬胰蛋白酶分子量為24.0 kD，水產魚類中胰蛋白酶分子量在20～30 kD［11］。國外關于蝦類胰蛋白酶分子量的報道較多，如Osnes等從南極大磷蝦中提取到3種胰蛋白酶相對分子量為32～33 kD。Anheller等從南極大磷蝦的提取物中得到相對分子量在24～33 kD的3種絲氨酸胰蛋白。

胰蛋白酶含有催化三聯體氨基酸，具有決定結合底物特異性的一個關鍵氨基酸Tyr;位于催化活性部位絲氨酸附近的氨基酸(Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro)是絲氨酸蛋白酶的典型特征序列［12］。研究表明，鰲蝦胰蛋白酶氨基酸序列中含6個半胱氨酸殘基，而脊椎動物中含12個。大多數蛋白質都含有一段保守序列，這是絲氨酸蛋白酶的特性。無脊椎動物中胰蛋白酶N端開始的氨基酸序列均為IVGG，此序列是胰蛋白酶的保守序列［3］。

系統發育分析的結果能夠反映各種動物的分類地位與進化上的關系，筆者在NCBI數據庫中下載胰蛋白酶的氨基酸序列，進行序列比對，構建系統發育樹，以分析胰蛋白酶基因的分子進化特征。

1 材料與方法

1.1 材料 在NCBI數據庫中下載動物胰蛋白酶氨基酸序列，序列為Fasta格式。

1.2 方法 首先進入 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/下載胰蛋白酶的氨基酸序列。將下載的胰蛋白酶氨基酸序列用CLUSTAL X2程序進行比較，同時運用MEGA3.1軟件包的Neighbor-joining法構建進化樹，并用相關方法檢測樹的可靠性。

2 結果與分析

2.1 序列比對分析 對11個物種的胰蛋白酶氨基酸序列進行比對，物種分別為Mus musculus(小家鼠)、Scylla paramamosain(青蟹)、Tribolodon hakonensis(珠星三塊魚)、Homo sapiens(人類)、Marsupenaeus japonicus(日本對蝦)、Litopenaeus vannamei(南美白對蝦)、Myxocyprinus asiaticus(胭脂魚)、Gadus chalcogrammus(狹鱈)、Culex quinquefasciatus(致乏庫蚊)、Portunus trituberculatus(三疣梭子蟹)、Rattus norvegicus(褐家鼠)。序列比對結果表明，絲氨酸家族胰蛋白酶具有保守的催化三聯體活性位點組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)，且含有6個保守的半胱氨酸形成3對肽內二硫鍵。在第3個催化三聯體活性位點附近有絲氨酸蛋白酶的典型特征序列:G-D-S-G-G-P(Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro)，在此特征序列之前的8個氨基酸也十分保守，除trypsinX3物種外，其他物種的氨基酸序列大都為Glu(谷氨酸)-Gly(甘氨酸)-Gly(甘氨酸)-Lys(賴氨酸)-Asp(天冬氨酸)-Ser(絲氨酸)-Cys(半胱氨酸)-Gln(谷氨酰胺)(其中S.paramamosain、C.quinquefasciatus和P.trituberculatus的丙氨酸以及C.quinquefasciatus的纈氨酸除外)。在N端附近，除trypsinX3物種外，其他物種胰蛋白酶都具有IVGG氨基酸序列。在C端附近，所有物種都有一段保守序列WI(G.chalcogrammus除外);除trypsinX3物種外，其他物種胰蛋白酶都具有VSWG、GCA以及PGVY氨基酸保守序列(C.quinquefasciatus除外)。胰蛋白酶氨基酸序列的底物結合位點為Asp(天冬氨酸)，該殘基通過電荷作用而穩定底物裂解位點，因而也決定著胰蛋白酶的專一性(圖1)。

2.2 系統進化樹分析 下載了28個物種的胰蛋白酶氨基酸序列，物種分別為Aedes aegypti(埃及斑蚊)、Anopheles gambiae(岡比亞按蚊)、Anopheles sinensis(中華按蚊)、Culex pipiens(尖音庫蚊)、C.quinquefasciatus(致乏庫蚊)、Danaus plexippus(黑脈金斑蝶)、Antheraea pernyi(柞蠶)、Antheraea yamamai(天蠶)、Choristoneura fumiferana(云杉芽卷蛾)、Manduca sexta(煙草天蛾)、L.vannamei(南美白對蝦)、M.japonicus(日本對蝦)、S.paramamosain(青蟹)、P.trituberculatus(三疣梭子蟹)、Portunus pelagicus(遠海梭子蟹)、H.sapiens(人類)、R.norvegicus(褐家鼠)、M.musculus(小家鼠)、M.asiaticus(胭脂魚)、Lutjanus fulvus(黃足笛鯛)、T.hakonensis(珠星三塊魚)、Ctenopharyngodon idella(草魚)、G.chalcogrammus(狹鱈)、Boreogadus saida(北鱈)、Paranotothenia magellanica(毛利鱈魚)、Oncorhynchus masou(馬蘇麻哈魚)、Parahucho perryi(哲羅魚)、Salvelinus leucomaenis(紅點鮭)。

結合Neighbor-joining方法，使用Mega3.1軟件構建了系統進化樹(圖2)。從圖2可以看出，不同物種來源的胰蛋白酶在進化樹上分為2個大分支，分別屬于無脊椎動物和脊椎動物。其中無脊椎動物分支中又有2個小分支，分別為蚊蟲類、蝦蟹類。脊椎動物也有2個分支，trypsinX3物種被單獨分為一支，其他脊椎動物(人類、鼠類、魚類)聚為一支。

3 討論

對下載的胰蛋白酶基因的氨基酸序列進行分析表明，脊椎動物與無脊椎動物的胰蛋白酶氨基酸序列有一定的同源性。這些序列中有胰蛋白酶所特有活性三聯體、底物結合部位的Gly殘基，及其他結構上的保守區域，如VSWG、GCA以及PGVY序列。在絲氨酸蛋白酶中，催化三聯體結構之間通過氫鍵相互作用，His通過吸收來自Ser的一個質子，從而激活催化反應［13］。

系統進化分析結果能夠反映各種動物的分類地位與進化上的關系:首先是脊椎動物與無脊椎動物這2種動物的最先分化，然后依次分化出人類、鼠類、魚類、蚊蟲類、蝦蟹類。系統進化分析結果與現有的以表型特征為依據的分類結果一致，證明利用保守的胰蛋白酶基因進行系統進化分析可以對現行的以外形結構特點為依據的分類系統加以驗證，為判斷各物種的分類地位和親緣關系提供準確可靠的分子標記。綜上所述，該研究對多種動物胰蛋白酶基因進行了序列比對與系統發育分析，針對胰蛋白酶基因的共性進行了詳盡的分析，期望能以此作為基礎，進一步探索胰蛋白酶基因的生物學功能。

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