3種酸堿環(huán)境模擬方法的比較

劉龍昌　司衛(wèi)杰　周紅麗　王菲　陳然　周正軍

摘要：比較研究NaOH/HCl法、磷酸緩沖液法和綜合法不同酸堿環(huán)境模擬方法對確定適宜的方法具有重要意義。以白菜（Brassica rapa var. chinensis）為試驗材料，研究NaOH/HCl法、磷酸緩沖液法和綜合法對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響。結果表明，不同模擬方法的萌發(fā)指數、活力指數、根長和苗長在所有pH值條件下均有極顯著差異（P

關鍵詞：pH值；酸堿環(huán)境；模擬方法；萌發(fā)指數；活力指數；根長；苗長；白菜

中圖分類號： O655.22 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0426-06

在植物的生活史中，種子萌發(fā)和幼苗階段是植物對環(huán)境脅迫忍耐力最小的階段[1]。除了種子自身的健康狀況、休眠等內部因素以外，種子能否順利萌發(fā)出苗，還受到外界環(huán)境因子如溫度、光照、pH值、土壤水分和鹽分等的影響[2-3]，pH值是影響土壤養(yǎng)分形態(tài)和有效性的主要因素之一[4]。大多數植物適合在中性土壤中生長，pH值過高或過低都會影響種子萌發(fā)和幼苗生長[5]，也可能會使植物所需營養(yǎng)元素的生物有效性發(fā)生變化，進而導致植株某些營養(yǎng)元素失調[6]。pH值也可通過影響種子的蛋白水解酶活性或膜勢能影響種子的萌發(fā)[7-8]。

在研究 pH 值對植物種子萌發(fā)和幼苗生長的影響時，不同研究者往往采用不同的方法模擬土壤的酸堿環(huán)境，目前涉及的模擬方法多達近10種[9-12]。按化合物種類和作用原理的不同，可將其可分為三大類：強酸堿法[13]、磷酸緩沖液法[3，14]、綜合法，即不同 pH 值區(qū)段采用不同的緩沖溶液[2，15]。因所采用的化合物種類不同，上述各種模擬溶液中的離子類型和離子強度就會明顯不同，不同模擬方法pH值的穩(wěn)定性也會有一定差異。因此，從理論上來說，采用不同方法模擬的研究結果可能會有很大差異。但是，目前尚缺乏這方面的實證性研究報道。因此，本研究以白菜（Brassica rapa var. chinensis）為試驗材料，對比研究3種常用方法的模擬效果，以期為確定適宜的模擬方法提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇對酸堿脅迫比較敏感的白菜為研究材料，挑選成熟度好且健康飽滿的種子作試材。種子活力的測定采用氯化三苯四氮唑（TTC）法，經測定種子活力達95%以上。

1.2 種子萌發(fā)試驗

用pH值分別為4、5、6、7、8 、9、10等7 個水平的模擬酸堿溶液為培養(yǎng)液，以蒸餾水為對照，進行種子萌發(fā)試驗。各處理培養(yǎng)皿中初次加入約7 mL培養(yǎng)液浸濕濾紙，以后每天加入1～3 mL相同pH值的培養(yǎng)液以保持濾紙濕潤。在試驗過程中，每2 d更換1次濾紙，補充相同pH值培養(yǎng)液，以保持培養(yǎng)皿內pH值恒定。將培養(yǎng)皿置于人工智能培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光暗周期12 h/12 h，光照度 250 μmol/（m2·s），溫度25 ℃，每個處理水平均設4個重復。

采用2種種子預處理方法：（1）蒸餾水浸種處理。將白菜種子用1%次氯酸鈉溶液消毒5 min，自來水沖洗5 min后用蒸餾水浸泡3 h，然后濾干種子。（2）培養(yǎng)液浸種處理。用各培養(yǎng)液浸泡3 h，其他處理同上。

1.3 3種酸堿模擬溶液的配制方法 （1）NaOH/HCl法。用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液將蒸餾水調配制pH值分別為4、5、6、7、8、9、10的溶液[16]。（2）磷酸緩沖液法。用0.2 mol/L NaH2PO4溶液和0.2 mol/L Na2HPO4溶液配制pH值分別為4、5、6、7、8、9、10的緩沖液[3，14]。（3）綜合法。用2 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀與1 mol/L HCl配制成pH值為4的緩沖液；用2 mmol/L 2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）與 1 mol/L NaOH 配制pH值分別為5、6的緩沖液，用2 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 與1 mol/L NaOH 配制pH值分別為7、8的緩沖液，用2 mol/L N-三（羥甲基）甲基甘氨酸與1 mol/L NaOH配制pH值為9、10的緩沖液[2]。

1.4 數據處理及統(tǒng)計分析

發(fā)芽試驗以胚根露出種皮 2 mm 作為萌發(fā)的標志，每 12 h 統(tǒng)計發(fā)芽數，連續(xù)12 h無種子發(fā)芽即結束發(fā)芽試驗，并于試驗后72 h測定根長和苗長。計算萌發(fā)率Gr、萌發(fā)指數Gi和活力指數Vi。其中：萌發(fā)率Gr=發(fā)芽種子數/試驗種子數×100；萌發(fā)指數Gi=∑Gt/Dt（Gt為第t天時的萌發(fā)數，Dt為相應的萌發(fā)時間；活力指數Vi=S×∑Gt×Dt（S為幼苗的平均長度=根長+苗長）[11]。其中，萌發(fā)率和萌發(fā)指數為萌發(fā)參數；苗長、根長和活力指數為生長參數。

對種子萌發(fā)率等數據進行反正弦轉換，采用SPSS 18.0軟件包進行顯著性檢驗、單因素方差（One Way ANOVA）分析和多重比較（LSD），用Excel 2003作圖，研究結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 3種酸堿環(huán)境模擬方法對種子萌發(fā)的影響

表1顯示，蒸餾水浸種時，不同模擬方法的萌發(fā)率雖有一定差異，但未呈現規(guī)律性變化，pH值為5、8、10時差異顯著，其他pH條件下差異不顯著；此時，所有pH值條件下的萌發(fā)指數均差異極顯著；處理液浸種時，所有pH值條件（除了pH值為6的以外）下，不同模擬方法的2 個萌發(fā)參數差異顯著或極顯著，且這種差異主要存在磷酸緩沖液法與其他2種方法之間。用處理液浸種時，這種差異更大一些，2種浸種方法預處理后的試驗結果相似，都是磷酸緩沖液法的最低。采用NaOH/HCl法時，pH值在4～10的條件下，2種浸種方法的萌發(fā)率均差異不顯著，但處理液浸種的萌發(fā)指數顯著或極顯著低于蒸餾水浸種。蒸餾水浸種時，僅pH值為10的萌發(fā)率與對照差異顯著（P<0.05），其他pH值條件下差異均不顯著；pH值為5～7的萌發(fā)指數與pH值為9～10的差異顯著，其他pH值條件下差異均不顯著；用處理液浸種時，pH值為6的萌發(fā)率與對照十分接近，它們與pH值為5、7～9的萌發(fā)率差異不顯著，與pH值為4、10的差異顯著（Pendprint

從3種模擬方法的種子萌發(fā)進程（圖1、圖2）可知，磷酸緩沖液法的種子萌發(fā)率最低，萌發(fā)速度最慢。

2.2 3種酸堿環(huán)境模擬溶液對白菜種子活力指數及苗長、根長的影響

表2顯示，pH值在4～10之間時，不同模擬方法的3 個生長參數差異均極顯著，且這種差異主要存在于磷酸緩沖液法與其他2種方法之間。2種浸種法預處理后的試驗結果也比較一致，都是磷酸緩沖液法最低。采用NaOH/HCl法時，2種浸種方法的苗長（pH值為4～10）、pH值為6～7的根長、pH值為6～8的活力指數差異均不顯著，其他pH值條件下的處理液浸種的活力指數和根長均顯著或極顯著低于蒸餾水浸種。采用蒸餾水浸種時，pH值為5的活力指數與對照差異顯著，其他pH值條件下差異均不顯著，所有pH值條件下的根長、苗長與對照差異均不顯著。采用處理液浸種時，pH值為6～7的活力指數與對照差異不顯著，其他pH值條件下與對照差異顯著或極顯著；pH值為6～7的根長與對照差異顯著，其他pH值條件下與對照差異極顯著；pH值為4～10的苗長與對照差異均不顯著。采用磷酸緩沖液法時，pH值在 4～10 的條件下，2種浸種方法的苗長差異均不顯著；除中性（pH值為7）條件下的根長差異不顯著外， 其他pH值條件下的根長和活力指數均差異顯著，且均是處理液浸種的低于蒸餾水浸種的。同時，2種浸種方法的上述3個生長參數在所有pH值條件下均極顯著低于對照。采用綜合法時，2種浸種方法的苗長（pH值為4～9）、根長（pH值為6～7）、活力指數（pH值為5～7）差異均不顯著，其他pH值條件下的處理液浸種的活力指數和根長均顯著或極顯著低于蒸餾水浸種。采用蒸餾水浸種時，pH值為5～7的活力指數和根長與對照差異不顯著，其他pH條件下均差異顯著或極顯著；在pH值為 4～10 的條件下，苗長與對照差異均不顯著。采用處理液浸種時，pH值為6的活力指數和根長與對照差異均不顯著，其他pH值條件下差異顯著或極顯著；pH值為4～8時的苗長與對照差異不顯著，僅pH值為9～10時差異極顯著。

上述研究結果表明，磷酸緩沖液不僅對白菜種子萌發(fā)的抑制作用顯著，而且對幼苗生長的抑制作用也顯著，因而不宜作為酸堿環(huán)境的模擬方法。同時，綜合種子萌發(fā)和幼苗生長2個階段的研究結果不難看出，綜合法模擬的結果更接近白菜種子對酸堿環(huán)境的適應情況。

3 結論與討論

土壤pH值是影響種子萌發(fā)和幼苗生長的重要環(huán)境因子[17]，不同植物有不同的pH值適應范圍。中性和偏酸性的環(huán)境有利于白菜種子萌發(fā)和幼苗生長，堿性和強酸性環(huán)境有顯著抑制作用[18-19]。在本研究中，3種模擬方法在偏酸性和中性條件下的5 個參數值均最大（表1、表2）。研究結果進一步證實，中性和偏酸性的環(huán)境有利于白菜種子萌發(fā)和幼苗生長。

在強酸性或堿性條件下，NaOH/HCl法的各參數值仍然維持很高的水平，尤其在蒸餾水浸種時。而此時，綜合法的各參數值卻顯著低于對照。在pH值為4～10的條件下，磷酸緩沖液法的各參數均遠低于對照，且在大多數情況下，萌發(fā)的幼苗多為畸形苗或黃化苗。這表明磷酸緩沖液對白菜種子萌發(fā)和幼苗生長有明顯的抑制和毒害作用，是最不適宜的模擬方法。綜合法更接近白菜種子對酸堿環(huán)境的實際適應情況，是最佳方法。

因種子萌發(fā)所需的物質和能量主要依靠自身貯存的營養(yǎng)提供，加之有種皮的保護，所以相對于幼苗階段，種子萌發(fā)階段受不良環(huán)境的影響會小一些[13，20]。萌芽速度快的種子受到的影響會更小，尤其在吸足水分后。因為在不良環(huán)境產生的脅迫作用顯現之前，種子已經完成了萌發(fā)過程。這應該是白菜種子萌發(fā)率在所有pH值條件下均很高的主要原因（磷酸緩沖液法除外），這種萌發(fā)情況顯然與白菜的實際狀況不相符。另外，在野外條件下，種子一開始就處于相應的酸堿環(huán)境中。因此，采用處理液浸種才能更好地反映種子對酸堿環(huán)境的實際適應能力。

采用NaOH/HCl和Na2HPO4/NaH2PO4等離子化合物模擬酸堿環(huán)境時，不僅pH值會對種子萌發(fā)和幼苗生長產生影響，而且這些化合物還可通過滲透效應和離子效應對種子產生鹽脅迫[21-22]。有的研究表明，在鹽迫害中起主要抑制作用的是滲透脅迫[23]；有的研究表明，起主要作用的是離子效應，尤其是Na+毒害作用[24]。過多的Na+會使相關代謝酶失活而對種子萌發(fā)和幼苗生長產生毒害作用[25-26]。一定濃度的磷酸根也會對種子萌發(fā)和幼苗生長產生明顯的抑制作用[27]。在本研究中，NaOH和HCl的濃度為1 mol/L，而Na2HPO4和NaH2PO4濃度僅為0.2 mol/L。前者的離子濃度雖遠高于后者，但是在所有pH值條件下，后者對白菜種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用都遠大于前者。由此可知，離子效應（尤其是磷酸根的存在）應該是白菜種子萌發(fā)和幼苗生長受到嚴重抑制的主要原因。采用綜合法時，因各pH值區(qū)段使用的化合物濃度僅為2 mmol/L，并且各區(qū)段化合物均處于其最適緩沖范圍內，所以調節(jié)pH值時使用的NaOH和HCl量也很小，加之使用的又多是非離子化合物（如HEPES）。因此，該方法的離子濃度遠低于前2種方法，因大量離子的存在而引起的滲透效應和離子毒害也必然會小很多，這也應該是該方法模擬效果最好的主要原因。

在探討pH值對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響時，須要提供穩(wěn)定的pH值環(huán)境。不同模擬方法的pH值穩(wěn)定性往往不同，由于有同離子效應，緩沖液法的穩(wěn)定性好于NaOH/HCl法。又由于綜合法在不同pH值區(qū)段采用了處于最適緩沖范圍的緩沖液，所以其pH值的穩(wěn)定性（即緩沖效果）應該是最好的。無論是在處理液配制過程中，還是在種子萌發(fā)的過程中，NaOH/HCl溶液都容易發(fā)生pH值的躍變，這必然會影響研究結果的準確性，這也應該是該方法模擬效果不佳的主要原因之一。

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