銀杏花粉及其發酵飲料的總黃酮含量及總黃酮測定方法比較

裘紀瑩　陳相艷　劉孝永　王未名　周慶新　張翔　陳蕾蕾

摘要：為了檢測銀杏花粉及其發酵飲料的總黃酮含量，對銀杏花粉發酵飲料的水解條件進行了優化，采用高效液相色譜-質譜聯用技術對水解得到的3種苷元進行了鑒定，采用高效液相色譜（HPLC）對3種苷元的含量進行了定量分析，并換算得到銀杏花粉及其發酵飲料的總黃酮含量，最后將高效液相色譜測定銀杏花粉總黃酮的方法與紫外分光光度計法、比色法進行了比較。結果表明，優化的銀杏花粉發酵飲料水解條件為鹽酸濃度0.6 mol/L，水解時間40 min。水解液中的3種苷元分別為槲皮素、山柰酚、異鼠李素。高效液相色譜法測定的銀杏花粉及其發酵飲料的總黃酮含量分別為21.40 mg/g、93.04 μg/mL。紫外分光光度計法和比色法準確性低，干擾因素多，均不適用于銀杏花粉及其發酵飲料的總黃酮測定。

關鍵詞：銀杏；總黃酮；花粉；發酵飲料；含量測定；測定方法

中圖分類號： TS201.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0371-03

銀杏是我國特有的珍稀植物，被稱為植物界的“活化石”。銀杏樹渾身是寶，其果、葉、苗具有重要的食用、藥用、觀賞價值。目前，國內外利用銀杏葉、銀杏果提取物開發出多種藥品、保健品。但是，關于銀杏花粉的研究比較少，國內學者大多僅從生物學角度研究其形態特征、生長發育、基本化學成分、人工授粉等，關于銀杏花粉產品開發及活性物質研究還比較欠缺。筆者以銀杏花粉為原料，采用益生菌發酵技術，研制出銀杏花粉益生菌發酵飲料，采用高效液相色譜法測定銀杏花粉原料及發酵飲料中總黃酮的含量，旨在為開發利用銀杏資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀杏花粉采自山東省郯城縣，干燥過100目篩。銀杏花粉發酵飲料由筆者所在實驗室自行研制。槲皮素、山柰酚、異鼠李素對照品（純度≥98%）均購自山東省中藥化學對照品/標準品工程技術研究中心。 甲醇為色譜級；濃鹽酸、磷酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

Mettler AE240電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）， Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS液相色譜-質譜聯用系統（美國Agilent公司）， Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司），UV-160型紫外可見分光光度計（日本島津公司），BK-120F 型超聲波清洗器（濟南巴克超聲波科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 待測樣品制備 參照王國霞等的方法[1]制備銀杏花粉樣品。精確吸取一定量的銀杏花粉發酵飲料，加入一定量的濃鹽酸、10 mL 100%甲醇，總體積為25 mL，閉塞后在天平上精確稱質量，加人沸水浴中水解一定時間，快速冷卻，再次稱質量并用100%甲醇補足失質量，搖勻并過濾，用0.45 μm濾膜過濾濾液，作為供試品溶液。

1.3.2 對照品溶液制備 分別精確稱取干燥至恒質量的槲皮素、山柰酚、異鼠李素對照品，加100%甲醇制成濃度分別為74、56、38 μg/mL的混標溶液，再用0.45 μm濾膜過濾，即為對照品儲備液。將儲備液稀釋不同倍數各進樣10 μL，按色譜條件測定，以峰面積和濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。

1.3.3 液相色譜檢測條件 ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，4.6 mm×150 mm，5 μm；甲醇-0.2%磷酸水溶液（50 ∶ 50）為流動相，流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm，柱溫：35 ℃，進樣量：10 μL。

1.3.4 樣品測定及總黃酮計算 分別吸取各樣品溶液10 μL，注入液相色譜儀。將色譜圖中3種苷元的峰面積代入回歸方程進行外標法定量，求出樣品溶液濃度，再換算成樣品含量。每個樣品3次重復，取平均值。總黃酮含量計算公式[2]如下：總黃酮含量=槲皮素含量×2.51+山柰酚含量×2.64+異鼠李素含量×2.39。

1.3.5 質譜鑒定條件 檢測模式：正離子模式；離子源：ESI（+）；霧化氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10.0 L/min；霧化氣壓：30 psi（206.85 kPa）；毛細管電壓：3 500 V；碎裂電壓：175 V；Skimmer電壓：65 V；八極射頻電壓：750 V；離子質量掃描范圍：100～3 000 m/z。

2 結果與分析

2.1 標準曲線及相關系數

將混合對照品儲備液稀釋不同倍數各進樣10 μL，以峰面積（Y）與溶液的濃度（X）進行線性回歸分析，得到回歸方程和相關系數（r2），分別為：

槲皮素：Y=38.102X-13.101，r2=0.999 9；

山柰酚：Y=37.515X+1.308 4，r2=0.999 7；

異鼠李素：Y=92.980X-34.230，r2=0.999 9。

混合對照品溶液的色譜圖見圖1，此色譜條件下3種對照品在13 min內得到良好的分離。

2.2 銀杏花粉3種苷元的質譜鑒定結果

采用高效液相色譜法檢測樣品中的黃酮苷元，銀杏花粉及其發酵飲料的色譜圖分別如圖2、圖3所示，在混合對照品相同保留時間處均有出峰。

采用液質聯用技術對銀杏花粉樣品中與對照品相同保留時間的組分進行分析，質譜圖見圖4。圖4-A組分的保留時間與槲皮素對照品一致，[M+H]+分子量為303.049 6，與槲皮素對照品一致，故鑒定為槲皮素。圖4-B組分的保留時間與山柰酚對照品一致，[M+H]+分子量為287.055 2，與山柰酚對照品一致，故鑒定為山柰酚。圖4-C組分的保留時間與異鼠李素對照品一致，[M+H]+分子量為317.065 3，與異鼠李素對照品一致，故鑒定為異鼠李素。endprint

2.3 銀杏花粉發酵飲料水解酸度、水解時間選擇

選取3份銀杏花粉發酵飲料，采用不同的鹽酸濃度、時間進行供試品溶液制備，結果如表1所示。

張平安等在對銀杏葉及其提取物進行酸水解時發現，用1.5 mol/L鹽酸水解效果最好[2]。王國霞等采用25 mL水解液（V甲醇 ∶ V25%鹽酸=4 ∶ 1）水解銀杏花粉，水解時間為40 min，結果表明，銀杏花粉郯城02的槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量分別為0.33、7.83、0.10 mg/g，總黃酮含量為21.74 mg/g[1]。鹽酸濃度過低時水解不充分，濃度過高時苷元容易降解；將發酵飲料冷凍干燥后測得的總黃酮為94.59 μg/mL，發酵飲料直接水解測定的總黃酮含量只有39.83 μg/mL。可見，發酵飲料直接加水解液水解的方法導致測定結果偏低。原因是發酵飲料中90%以上是水，而銀杏花粉總黃酮的含量較低，加入25 mL水解液（V甲醇 ∶ V25%鹽酸=4 ∶ 1）后，鹽酸濃度被進一步稀釋， 導致發酵飲料中的黃酮水解不充分。如果將發酵飲料冷凍干燥后測定固然結果比較準確，但是耗時耗力，成本較高。如表1所示，在一定量的銀杏花粉發酵飲料中加入一定量的濃鹽酸、10 mL 100%甲醇，總體積為25 mL，25 mL體系中的鹽酸濃度分別為0.60、0.36 mol/L，分別水解30、40 min，結果表明，13.75 mL發酵飲料中加1.25 mL濃鹽酸、10 mL 100%甲醇，水解40 min的總黃酮含量最高，為93.04 μg/mL，與發酵飲料凍干粉的測定結果非常接近?？梢姡捎么朔椒▽Πㄣy杏花粉發酵飲料在內的銀杏花粉稀溶液進行水解，操作方法比較簡單，同時測定結果比較準確。

2.4 高效液相色譜法與分光光度計法的比較

采用分光光度計測定總黃酮含量主要有紫外分光光度計法[3]、比色法[4] 2種方法。3種方法測定銀杏花粉及其發酵飲料總黃酮含量見表2、表3。

由表2、表3可知，采用紫外分光光度計法測定銀杏花粉的總黃酮含量是采用比色法的3.7～3.9倍，是采用高效液相色譜法的2.3～2.5倍。采用紫外分光光度計法測定發酵飲料的總黃酮含量是比色法的4.37倍，是高效液相色譜法的6.27倍。用乙酸乙酯提取發酵飲料后，采用3種方法測定的總黃酮含量均明顯下降。紫外分光光度計法是利用黃酮類化合物在200～400 nm區域內有很強的吸收帶，在258 nm處有1個最大吸收峰，在360 nm處也有1個肩峰。這使得利用紫外吸收作為評價黃酮含量指標成為可能。該方法簡單，但易受底液、干擾組分、溶液渾濁、吸收池不干凈的影響。從發酵飲料乙酸乙酯提取前后的巨大差異可知，此方法準確度最差，非黃酮組分對結果影響很大，導致測定結果偏高。比色法是當前測定總黃酮使用最為廣泛的方法，以蕓香苷為標準品，利用黃酮類化合物官能團中的3-或5-OH及鄰二酚羥基與Al3+絡合，形成黃色物質，再加入NaOH生成紅色，在510 nm處有最大吸收峰，但此方法結果易受底液、干擾組分等的影響。郭亞健等研究結果顯示，黃酮類成分黃芩苷、黃芩素、香蒲新苷、山柰酚、槲皮素、橙皮苷在500 nm左右處無吸收或吸收較弱，非黃酮類成分咖啡酸、原兒茶醛、綠原酸、原兒茶酸在波長500 nm左右處有最大吸收或吸收較強，香草醛、阿魏酸等也有一定吸收[5]。此方法專屬性不強，有局限性，準確性較差。從液相檢測結果可知，銀杏花粉水解后的苷元主要是山柰酚，還有少量槲皮素、異鼠李素。本研究結果表明，山柰酚對照品在500 nm左右處幾乎無吸收，槲皮素也只有較弱吸收，故比色法測定銀杏花粉時結果偏低。由于發酵飲料成分比較復雜，顏色偏深，影響比色法測定，導致結果偏高。比色法不適合用于銀杏花粉及其發酵飲料總黃酮含量的測定。采用高效液相色譜法測定銀杏花粉發酵飲料總黃酮，用乙酸乙酯提取后的總黃酮含量下降較多，主要是因為提取不充分以及分離、回收提取液時的損耗較大。又因為采用高效液相色譜法時雜質組分及色澤對發酵飲料總黃酮測定結果幾乎無影響，故只要將銀杏花粉發酵飲料直接水解即可上機測定。

3 結論與討論

本研究結果表明，紫外分光光度計法、比色法均不適用于銀杏花粉及其發酵飲料的總黃酮測定，高效液相色譜法專一性強，雜質和色澤影響小，準確度、精確度高，適用于銀杏花粉及其發酵飲料的總黃酮含量測定。采用高效液相色譜-質譜聯用技術對水解液的3種苷元進行鑒定，3種苷元分別為槲皮素、山柰酚、異鼠李素。銀杏花粉及其發酵飲料應采用不同的酸水解方式。發酵飲料的酸水解宜直接添加濃鹽酸，以便提高水解液體系中的鹽酸濃度，使水解更加充分。同時注意鹽酸添加量也不宜過高，一方面過高鹽酸含量會造成黃酮苷元的降解，另一方面也會變相稀釋銀杏花粉發酵飲料，導致其中低濃度的苷元不易檢出。采用25 mL水解液體系鹽酸濃度0.6 mol/L水解40 min比較合適。采用高效液相色譜法檢測了銀杏花粉及其發酵飲料的總黃酮含量。銀杏花粉的總黃酮含量平均為21.40 mg/g，發酵飲料的總黃酮含量為93.04 μg/mL，此含量比培養液滅菌和接種前略低，主要原因可能是滅菌時的高溫降解以及微生物生物轉化的影響。

參考文獻：

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