1株斜生柵藻擴大培養條件的優化

季祥　成杰　廖利民　鞏東輝　蔡祿　齊云　陳冠益

摘要：為了促進微藻快速生長、提高微藻生物量，在試驗室條件下對1株含油量相對較高、長勢較好的斜生柵藻進行10 L擴大培養，并通過單因素和正交試驗對4種主要營養鹽進行優化。結果表明，在擴大培養的10 L反應器中，斜生柵藻的最適生長條件為：NaNO3 1.0 g/L、K2HPO4·3H2O 0.10 g/L、MgSO4·7H2O 0.100 g/L、FeCl3·6H2O 0.008 g/L，斜生柵藻在該優化后的10 L培養基中生長情況良好，且最大生物量（D680 nm）可達1.91，分別是10 L-BG11、250 mL-BG11條件下的1.20、1.28倍。

關鍵詞：斜生柵藻；擴大培養；生物量；生長條件；優化

中圖分類號： Q968.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0303-03

隨著人類社會資源的短缺和環境問題的日益突出，世界各國正面臨著能源匱乏和生態環境破壞的危機，因此尋求一種新型的可再生能源成為世界各國科學家普遍關注的科學問題和發展趨勢[1]。生物柴油是清潔的、環境友好的可再生能源，但由于其原材料成本較高，目前生物柴油的價格仍高于傳統柴油。而在眾多的能源微生物中，微藻具有種類繁多、光合利用度高、自身合成油脂能力強等優點[2]。利用藻類油脂生產生物柴油具有緩解溫室效應，不與人爭糧、不與糧爭地的眾多優點，通過微藻油轉化生產生物柴油具有廣闊的開發利用前景。為了快速獲得較大的微藻生物量，對微藻的擴大培養顯得至關重要，而在不同反應器中，微藻對營養鹽的需求也不一樣。因此，筆者對試驗室的1株含油量較高的斜生柵藻進行了10 L擴大培養研究，對其生長條件進行了優化，最大限度地提高該藻的生物量，為其工業化生產應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藻種來源

試驗藻種為斜生柵藻（Scenedesmus obliquus），保存于內蒙古自治區生物質能源化利用重點實驗室。

1.2 培養條件

試驗采用10 L廣口瓶為反應器，以前期工作[3]改進的BG11培養基作為基礎培養基，裝液量為7 L，接種量5%，置于環境溫度（25±1） ℃、光照強度5 000 lx、光照周期14 L/10 d的條件下培養。

1.3 微藻生物量的測定

微藻生物量的測定采用濁度比色法[4]。本試驗采用752紫外可見分光光度計，在波長680 nm處測定培養液的吸光度（D680 nm），試驗結果數據采用SPSS Statistics 17.0、Origin Pro 8.0和Microsoft Office Excell 2007軟件進行分析處理。

1.4 斜生柵藻生長條件的優化

1.4.1 4種主要營養鹽單因子試驗 試驗對影響斜生柵藻生長最主要的N、P、Mg、Fe營養鹽進行研究，在接種前1 d分別換上不加N、P、Mg、Fe營養鹽的改進BG11培養基，培養24 h 后按0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的質量濃度加入NaNO3，按0、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 g/L的質量濃度加入K2HPO4·3H2O，按0、0.050、0.075、0.100、0.125 g/L的質量濃度加入MgSO4·7H2O，按0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 g/L的質量濃度加入FeCl3·6H2O。每組均作3個平行試驗，待微藻處于穩定生長期，取最大的D680 nm平均值，考察在不同濃度的N、P、Mg、Fe營養鹽條件下斜生柵藻的生長情況。

1.4.2 正交試驗 在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，按表1因素水平表中各水平分別加入NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O和FeCl3·6H2O營養鹽，參照正交試驗法[5]選用L9（34）設計進行正交試驗。

2 結果與分析

2.1 NaNO3對斜生柵藻生長的影響

微藻在增殖過程中需要營養物質，氮是微藻體內許多重要有機化合物的組成成分之一，在許多方面影響植物的代謝過程和生長發育。其中，氮是微藻細胞蛋白質葉綠素的組成成分，是組成核酸的重要元素之一，同時微藻體內的各種生物酶也含有氮[6]。微藻在生長過程中通常能利用銨鹽、硝酸鹽及尿素作氮源，本試驗以NaNO3為氮源，在培養基中加入不同質量濃度的NaNO3，考察不同質量濃度的NaNO3在10 L培養體系中對斜生柵藻生長的影響，結果如圖1所示。

從整體上看，隨著NaNO3質量濃度的不斷增加，斜生柵藻的生物量呈現出先上升后下降的趨勢。利用軟件分析可知，NaNO3質量濃度與斜生柵藻生物量呈極顯著正相關（P<0.01），且各組間生物量差異顯著（P<0.05）。當NaNO3質量濃度為0時，生物量最低；隨著NaNO3質量濃度的增加，柵藻生物量逐漸上升，當質量濃度為1.0 g/L時，斜生柵藻生物量在各組間最大，D680 nm為1.59，而持續增加NaNO3質量濃度并不能促進微藻的生長，生物量開始逐漸降低，說明過高質量濃度的NaNO3會抑制斜生柵藻的生長。由此得出，NaNO3最適質量濃度為1.0 g/L（圖1）。

2.2 K2HPO4·3H2O對斜生柵藻生長的影響

磷是植物生長發育心需的營養元素之一，是微藻體內許多有機化合物的組成成分，同時磷以多種方式參與微藻體內的各種代謝過程，是生物體內ATP、GTP、核酸、磷脂、輔酶等化合物合成的基本元素，在微藻生長發育中起重要的作用。本試驗以K2HPO4·3H2O為磷源，研究不同質量濃度的K2HPO4·3H2O對斜生柵藻生長的影響，結果如圖2所示。

由圖2可知，K2HPO4·3H2O質量濃度在0～0.14 g/L范圍內均能促進斜生柵藻生長，且生物量與其呈極顯著正相關（P<0.01）。當K2HPO4·3H2O質量濃度為0～0.10 g/L時，磷鹽對斜生柵藻生物量的促進作用明顯，同時在0.10 g/L時生物量達到最大；而當K2HPO4·3H2O質量濃度大于0.10 g/L 時，該藻的生物量呈現下降趨勢，但隨著磷鹽質量濃度緩慢增加，柵藻生長表現出一定的耐受性。因此，在10 L培養體系中，斜生柵藻的K2HPO4·3H2O最適質量濃度為 0.10 g/L。endprint

2.3 MgSO4·7H2O對斜生柵藻的生長影響

鎂是葉綠素的組成成分，在葉綠素合成和光合作用中起重要作用[7]，鎂還參與生物體內的氮代謝和活性氧代謝。在試驗中選取MgSO4·7H2O提供鎂元素，研究不同質量濃度的Mg2+對斜生柵藻擴大培養時生長的影響，試驗結果如圖3所示。

由圖3可知，斜生柵藻在不同質量濃度的MgSO4·7H2O條件下所達到的最大生物量有所差異。當培養液中不含鎂時，斜生柵藻生物量較低，當培養液中鎂元素存在時，可見其生物量迅速增加，由軟件分析可知，鎂質量濃度與微藻生物量是顯著正相關的（P<0.01），同時含有Mg2+與缺鎂條件下的生物量差異顯著（P<0.05）。而當MgSO4·7H2O質量濃度達0.05 g/L后，生物量表現出一定程度的先下降后上升的趨勢，但趨勢較緩，增量不明顯，差異也不顯著（P>0.05）。這可能主要是由于培養液中持續鎂質量濃度的增加，對微藻生長產生了一定的抑制作用，同時由于微藻機體自身的耐受能力，在微藻適應了較高質量濃度下的Mg2+后，出現一定程度的生長現象，可以推測后續持續增加鎂質量濃度會造成微藻生物量急劇降低。綜合以上分析結果可知，0.100 g/L為 MgSO4·7H2O 的最適質量濃度。

2.4 FeCl3·6H2O對斜生柵藻生長的影響

鐵元素在微藻生理上有重要作用，是一些重要的氧化-還原酶催化部分的組分。鐵雖然不是葉綠素的組成成分，但缺鐵時，葉綠體的片層結構發生很大變化，嚴重時甚至使葉綠體發生崩解。而且鐵在微藻體內以各種形式與蛋白質結合，作為重要的電子傳遞體或催化劑參與許多生命活動。本試驗以FeCl3·6H2O為鐵鹽，考察不同質量濃度的Fe3+對斜生柵藻擴大培養時生長的影響，試驗結果如圖4所示。

由圖4可知，盡管培養液中對Fe3+含量要求較低，但對微藻生物量的影響很大。由軟件分析結果可知，Fe3+與斜生柵藻生物量呈極顯著正相關（P<0.01）。當培養液中缺鐵時，斜生柵藻生物量較低；FeCl3·6H2O的增加能夠迅速促進微藻生物量的積累，當FeCl3·6H2O質量濃度達0.006 g/L時，生物量達到最高，D680 nm為1.59；而隨著質量濃度的進一步增加，微藻生物量開始降低，表現出抑制作用。說明適宜的Fe3+質量濃度能夠促進微藻細胞增殖，有利于生物量積累。因此，FeCl3·6H2O的最適質量濃度為0.006 g/L。

2.5 4種營養鹽對斜生柵藻生長影響程度和優化水平組合

在不同條件下，斜生柵藻對營養鹽的需求有很大的差異，為了研究斜生柵藻在擴大培養時的最佳培養基配比，采用正交設計對這4種營養鹽進行多因子組合試驗，按表1因素水平表分別加入營養鹽，在10 L反應器中培養，結果見表2。

由表2可知，4種營養鹽對斜生柵藻生長的影響程度從大到小為A>D>B>C，即NaNO3質量濃度>FeCl3·6H2O質量濃度>K2HPO4·3H2O質量濃度>MgSO4·7H2O質量濃度，NaNO3質量濃度水平對斜生柵藻生長的影響最大，其次為FeCl3·6H2O質量濃度。通過分析4因素的均值可知，4種營養鹽的最優水平組合為A2B2C2D3，即NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O的最佳質量濃度為1.0、0.10、0.008 g/L，通過后續試驗驗證可知，斜生柵藻在該優化條件下的生物量D680 nm可達1.91，是各試驗設計組中最高的。此外，在正交試驗中4種營養鹽的最適質量濃度與單因素的最適質量濃度相吻合的有NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O，而FeCl3·6H2O較單因素試驗中的質量濃度不同，這可能是由于各因素的交互作用所致。因此，以正交試驗分析所得的最適優化組合培養基對斜生柵藻進行10 L擴大培養，可以獲得斜生柵藻的最大生物量。

2.6 斜生柵藻在不同培養條件的生長情況

為了進一步驗證斜生柵藻10 L擴大培養的最佳營養鹽條件，將經正交試驗所得的營養鹽條件與BG11基礎培養條件分別在250 mL以及10 L培養體系下進行微藻整個生長周期的培養，試驗結果如圖5所示。

由圖5可知，斜生柵藻均能在3種不同培養條件下生長，總體生長趨勢相當，前6 d為調整期，6～15 d為對數生長期，18 d以后斜生柵藻逐漸進入到穩定生長期，27 d后藻細胞開始衰亡；在優化后的10 L培養體系條件下，斜生柵藻生長趨

勢明顯好于其余2組，且穩定期收獲的生物量最大，D680 nm可達1.91，遠高于10 L-BG11、250 mL-BG11條件下的D680 nm（1.58）、D680 nm（1.48），分別是該2組的1.20、1.28倍。此外，在外界環境條件、營養鹽條件相同的情況下，微藻反應體系對其生長影響較大，250 mL體系生物量小于10 L體系，這可能是由于較大反應器更有利于微藻的生長繁殖，特別是在微藻生長繁殖后期，由于微藻細胞密度不斷增大，光遮蔽效應日益明顯，微藻生長對環境空間以及營養鹽的需求表現得更加突顯。

3 結論

在單因素試驗中，NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O的最佳質量濃度為1.0、0.10、0.100、0.006 g/L。在10 L反應體系中，NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O的最佳質量濃度為1.0、0.10、010、0.008 g/L。后續試驗證明，斜生柵藻在10 L-優化培養中的生物量遠高于BG11基礎培養基，分別是10 L-BG11、250 mL-BG11培養條件的1.20、1.28 倍，同時10 L反應體系更利于微藻生長繁殖和生物量的積累，該研究也為微藻的擴大培養提供了依據。

參考文獻：endprint

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