微擬球藻中潛在C4循環對不同抑制劑、光質的響應

魏力

摘要：為了探討微擬球藻C3、C4循環在碳固定過程中的角色和功能，通過對其基因組、轉錄組進行解析，發現微擬球藻IMET1中存在編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸酶、丙酮酸磷酸雙激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等C4 途徑關鍵酶的基因。分析了關鍵C4基因的進化，并通過實時熒光定量PCR法檢測了微擬球藻在不同光質條件下C4基因（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶）表達量的變化。此外通過使用不同的化學抑制劑檢測這些潛在C4基因對其的響應。結果表明，IMET1中存在細菌型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，在系統同發育關系上，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因都與硅藻、褐藻進化關系很近。在白光、藍光、紅光等非生物脅迫條件下，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的基因表達在藍光下短期內會顯著升高，而后相對表達又下調。在某些脅迫條件下，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸磷酸雙激酶酶等活性的升高可能改變了微擬球藻IMET1碳代謝途徑的走向，C4代謝途徑功能加強。

關鍵詞：微擬球藻；C4循環；抑制劑；轉錄動態

中圖分類號： S917 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0298-05

根據光合作用碳素同化的最初光合產物的不同，高等植物的光合作用分為3類：分別是C3植物、C4植物、景天酸代謝（crassulacean acid metabolism，CAM）[1]。高等植物中，絕大多數植物（約占90%）使用C3循環進行CO2固定，即經典的卡爾文循環途徑，只有一些耐干旱植物（如高粱、玉米、稗草、黍類）才擁有C4循環。生長在極端干旱條件下的植物（如景天、仙人掌等）能利用CAM通路形式光合固碳[2]。與C3植物相比，C4植物具有較強的光合作用活性，它能通過碳濃縮顯著提高固碳酶-核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（rubisco）周圍的CO2濃度，進而提高光合固碳效率，并且能夠同時改善、提高氮和水的利用效率[3]。

目前，我國對浮游植物光合無機碳吸收機制的認識相對滯后，沒有像高等植物一樣明確分類。據報道，水生植物的某些種類（如Hydrilla、Egeria、Orcuttia、Eleocharis屬）可以進行C4形式的光合作用， 但它們并沒有大部分陸生C4植物擁有的Kranz結構。在某些非生物脅迫條件下，這些物種在葉綠體內能夠利用NADP 蘋果酸酶（NADP-ME）完成蘋果酸脫羧反應并釋放CO2，從而形成葉綠體內的CO2 濃縮機制（CO2 concentrating mechanism，CCM）。C3、C4 途徑將在同一細胞中進行，而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）和 rubisco分別定位在細胞質、葉綠體中起作用，這與C4陸生植物的C4循環存在很大不同[4]。水生植物黑藻（Hydrilla verticillata）具有C3 途徑的氣體交換和生化特征，但當暴露在低濃度的CO2 環境中10～12 d，會誘導產生C4 類型的CO2 濃縮機制[5]。此外，海洋藻類由于長期的進化適應仍通過低碳誘導的CO2 濃縮機制來增加主要的光合作用羧化酶rubisco 周圍CO2 的濃度[6]。通過這個機制能夠增加CO2 與O2 的比例，進而減少光呼吸過程中的能量浪費。海洋藻類光合作用的碳固定途徑一般被認為是C3 途徑，但是最近的同位素標記試驗、基因組測序數據表明，藻類中也存在潛在的C4 途徑，即CO2首先被固定形成四碳分子蘋果酸或草酰乙酸，如海洋硅藻威氏海鏈藻（Thalassiosira weissflogii）單細胞中存在C4途徑，在三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）中或許存在1個潛在的C4類似碳固定途徑[7]。然而，1個介于C3-C4之間的碳固定途徑被認為存在于假微型海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）中。因此，在不同的硅藻中，多種類型的CCM機制或許存在。綠藻（Ostreococcus tauri）中已經發現了C4 光合作用的相關基因[8]。這些C4基因包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、蘋果酸酶（ME）、蘋果酸脫氫酶（MDH）、丙酮酸磷酸雙激酶。其中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是一種在維管植物、古細菌、細菌、藍藻中廣泛存在的胞質酶，它在HCO3-存在的情況下，催化PEP形成O2、Pi，它是高等植物同化碳的酶[9]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）催化PEPC逆反應，普遍存在于動植物、微生物細胞中。盡管環境生態因子對光合作用的碳吸收途徑有較大影響，但是到目前為止，海洋藻類中有關這方面的認識仍是比較膚淺的。微擬球藻是單細胞光合微藻，廣泛分布于海洋、淡水等環境水域。這一類微藻能夠被廣泛應用于生物燃料、生物碳減排、其他高附加值等生物技術工業中，因此，認識微擬球藻的生理、代謝途徑是非常必要的。目前已經有多株微擬球藻完成了基因組測序，其中在基因組注釋中發現有C4基因的存在[10-13]。為了深入探索環境對微擬球藻的無機碳藻吸收影響及潛在C4循環的作用，本研究從微擬球藻光合放氧對外源無機碳的響應入手，探討微擬球藻、衣藻在不同抑制劑條件下的光合放氧及其表觀無機碳親和力，比較了在不同外界非生物環境脅迫（光質）條件下光合放氧的不同響應以及潛在C4基因的表達動態，旨在為微擬球藻在工業上遺傳改良提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藻種和培養條件

微擬球藻（Nannochloropsis oceanica） IMET1由美國馬里蘭大學陳峰老師友情饋贈，經反復分離純化至無菌。培養基配方來自于美國亞利桑那州立大學胡強教授實驗室修正后的f/2培養基，組成成分如下：35 g/L 海鹽，1 g/L NaNO3，67 mg/L NaH2PO4·H2O，3.65 mg/L FeCl3·6H2O，437 mg/L Na2EDTA·2H2O，trace metal mix（0.0196 mg/L CuSO4·5H2O、0.012 6 mg/L NaMoO4·2H2O、0.044 mg/L ZnSO4·7H2O、0.01 mg/L CoCl2、0.36 mg/L MnCl2·4H2O）和 vitamin mix（5 μg/L維生素B12、5 μg/L Biotin、 1 mg/L Thiamine HCl）。正式開始試驗前將N.oceanica IMET1在瓊脂平板上活化，挑取單克隆藻落接種于液體培養基中，控制培養過程溫度為25 ℃，連續光照，光照強度為50～85 μmol/（m2·s），通入空氣或混有1.5%CO2的空氣進行培養，連續活化培養3輪，再進行后續試驗。在不同光質處理試驗中，分別采用白光、藍光、紅光的光照LED燈進行試驗。萊茵衣藻（CC124）購自衣藻資源中心，培養于TAP培養基，配方參考自衣藻資源中心。endprint

1.2 微擬球藻的生長參數測定

將在白光下培養至對數生長期的微藻接種到柱式反應器，接種后分別在藍光、紅光、白光下培養，每天定時取樣1～3 mL測定藻液的D750 nm，同時測定光合作用效率（Fv/Fm），用Image-PAM （Walz GmbH，Germany）通過脈沖幅度調制測量微擬球藻活體光系統Ⅱ的熒光參數。先將樣品暗適應15～20 min，測量最小熒光產額（F0），然后應用飽和脈沖法測量最大熒光產額（Fm），PSⅡ的最大光化學效率（Fv/Fm）計算公式如下：

Fv/Fm=（Fm-F0）/Fm。

1.3 不同抑制劑對微藻的處理

采用不同的抑制劑抑制潛在的C4相關基因編碼酶（如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK），調查這些抑制劑對微擬球藻光合作用活性的影響，進而探討潛在的C4循環在微擬球藻的光合固碳中的功能。本研究中共使用了4種抑制劑：3-MPA、Rutin、Quercetin、Baicalein。其中，3-MPA是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC的抑制劑，其余3種抑制劑都是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK。通過添加不同抑制劑后測定光合放氧速率來探討其光合活性。

1.4 光合放氧速率的測定

采用液相氧電極方法測定光合放氧速率。離心收集對數生長期藻細胞，棄去上清，重懸于新鮮的培養基中，加入不同的化學抑制劑，取3 mL測定光合放氧速率。

1.5 微擬球藻潛在C4基因的分布比較、序列進化分析

微擬球藻潛在C4基因序列分別來自于GenBank和本實驗室基因組、轉錄組測序，用NCBI 上的BLAST X程序（WWW.ncbi.nlm.nih.gov/blast）將這些序列與其他一些已知序列進行同源性比較，再用ClustalW進行比對，用Mega 4.0程序構建系統發育樹。

1.6 微藻RNA提取和反轉錄制備cDNA

按照說明書的方法用Trizol試劑提取每種處理后的微擬球藻總RNA，用DEPC處理過的水溶解RNA。 用MoloneyMurine Leukemia Virus 反轉錄酶把RNA反轉錄成cDNA，用 Nannoview 對其濃度進行測量，隨后進行實時定量PCR分析。

1.7 熒光定量PCR試驗

用Roche的Light-cycle 480 Real-Time PCR 系統配合SYBR Green 熒光染料試劑盒對微擬球藻IMET1中潛在C4基因在不同光質脅迫條件下的轉錄動態進行實時熒光定量PCR反應。為了使選擇的基因相對表達量標準化，選用actin基因作為內參基因。根據PEPC、PEPCK、actin基因序列，用Primer Express 3.0 設計定量PCR引物（表1）。每個基因的表達都進行3次獨立重復，并且來自3個生物學重復。熒光定量PCR反應體系如下：10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ、1.0 μL 10 pmol/L上游引物、1.0 μL 10 pmol/L下游引物、2.0 μL cDNA、6.8 μL去離子水。熒光定量PCR反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，40 個循環。采用2-ΔΔCT 方法分析實時定量PCR結果。

2 結果與分析

2.1 微擬球藻中潛在C4基因的分布情況

基于目前已經完成的微擬球藻屬基因組，系統比較了C4基因在微擬球藻中的分布情況。通過比較發現，在微擬球藻IMET1、N.gaditana CCMP526、N.oceanica CCMP1779中都存在潛在的C4基因（PEPC、PEPCK、PPDK、NADP-ME、NAD-ME、MDH），在CCMP1779中不存在PEPCK基因（表2）。本研究關注的IMET1中存在所有潛在的C4基因，這就暗示我們它們或許也使用C4循環進行光合碳固定，也進一步提示我們需要探索這些潛在C4循環基因的功能，特別是在逆境條件下它們的功能。

2.2 潛在C4基因PEPC、PEPCK的序列進化分析

大多數高等植物中PEPC由多個拷貝構成，如在擬南芥、水稻中分別報道了4、6個，根據基因、蛋白結構可分為2種PEPC酶，分別是植物型PEPC、細菌型PEPC。筆者對微擬球藻IMET1中PEPC進行了進化分析。基因相似性分析表明，微擬球藻IMET1中存在1個細菌型PEPC酶，并且與相近物種硅藻、褐藻中的PEPC具有相對較高同源性，相似性為58%～65%。與微擬球藻N.gaditana有87%序列相似度（圖1）。硅藻中的PEPC被認為參與C4循環，因此筆者推測，微擬球藻中的細菌型PEPC或許也參與C4光合固碳，需要進一步證實。

在不同物種中，PEPCK 在細胞內分布、特性明顯不同，編碼基因序列、結構存在差異。IMET1中的PEPCK與硅藻、褐藻存在很大的序列相似性，而與綠藻序列相似度較低（圖2），這或許也暗示它潛在參與C4功能。

2.3 微擬球藻中潛在C4基因的轉錄動態

為了探討潛在的C4循環在微擬球藻中的角色與功能，筆者進一步測試了微擬球藻中潛在C4基因在應對外界環境變化時它們的轉錄動態。光質影響植物光合活性，進而影響植物光合固碳效率，因此筆者試圖從光質利用角度來闡述微擬球藻中潛在C4循環機制。通過熒光定量PCR試驗，筆者研究了微擬球藻中潛在的C4基因在不同波長光質（波長約680 nm 紅光、波長約450 nm藍光、白光）下的表達狀態，其中PEPC的表達在轉移到藍光條件下將被瞬時激活，從圖3可以看出，3、6 h，相對于白光、紅光，藍光條件下PEPC的表達豐度是最高的；9、12 h，PEPC在藍光下的表達豐度又降低，在白光條件下開始升高。筆者推測PEPC對光合固碳是有響應的。同樣，筆者也關注了PEPCK的表達變化，發現也是在6 h的藍光下表達豐度較高，因此，它的升高可能是在光合固碳中發揮作用。endprint

蘋果酸酶是廣泛存在于動物、植物以及原核生物的一類氧化脫羧酶。植物C4 型NAD-蘋果酸酶（NAD-ME）和NADP-蘋果酸酶（NADP-ME）是C4 光合途徑的關鍵酶，催化蘋果酸脫羧放出CO2，并產生丙酮酸，丙酮酸再生為PEP，使C4 途徑得以循環進行，CO2 則被Rubisco 酶重新固定而進入卡爾文循環途徑。PPDK是NADP-ME型植物C4光合途徑中催化丙酮酸轉化成CO2的原初受體磷酸烯醇式丙酮酸。鑒于它們在C4循環中的重要性，筆者也關注了它們的表達變化，發現在6 h藍光下，它們的表達豐度明顯高于白光、紅光下的表達水平（圖3）。因此，作為潛在的C4基因，它們也可能在光合固碳中起著重要角色。

2.4 微擬球藻IMET1在不同光質下光合活性

為了進一步認識微擬球藻在藍光等不同光質下的生理反應與潛在C4的關系，筆者比較了微擬球藻在不同光質條件下，光合系統Ⅱ最大光合效率（Fv/Fm）的變化。結果表明，在藍光條件下，微擬球藻的光合活性最高，紅光條件下的光合活性最低（圖4），這與潛在C4基因的表達或許存在相關性，可見，這些潛在C4基因影響微擬球藻光合活性，進而推測它們在微擬球藻固碳過程中發揮重要功能。

2.5 PEPCK酶抑制劑對植物光合作用活性的影響

為了進一步探討潛在C4基因是否參與光合固碳，筆者采用不同的抑制劑去抑制潛在的C4相關基因編碼酶（如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK），調查這些抑制劑對微擬球藻光合作用活性的影響，進而探討潛在的C4循環。盡管PEPCK酶廣泛存在于微生物、藻、高等植物中，負責從丙酮酸到磷酸烯醇式丙酮酸的脫羧反應，參與糖異生過程，但是在一些高等植物（如玉米、高粱、黍類等）中，PEPCK酶被認為是C4循環中的重要酶。筆者采用PEPCK酶特異的抑制劑3-MPA（3-mercaptopicolinic acid），3-MPA已經被廣泛用于PEPCK酶的抑制研究。比較微擬球藻、萊茵衣藻的PEPCK酶在特異抑制劑作用下，微擬球藻、萊茵衣藻光合作用活性變化，進而比較PEPCK酶在微擬球藻、萊茵衣藻生物功能的異同。通過抑制試驗結果發現，當在反應體系中加入5 mmol/L 3-MPA 用于抑制PEPCK酶時，微擬球藻、萊茵衣藻的光合活性明顯不同，微擬球藻的PEPCK酶被強烈抑制，萊茵衣藻的PEPCK酶被抑制不明顯，說明微擬球藻、萊茵衣藻的PEPCK酶對抑制劑3-MPA表現出不同光合活性（圖5）。通常認為萊茵衣藻的PEPCK酶不是參與C4，而是參與TCA循環的回補反應。可見，3-MPA能抑制IMET1中磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化過程，因此微擬球藻IMET1中部分CO2的固定可能是由PEPCK負責的。

2.6 PEPC酶抑制劑對微擬球藻光合作用活性的影響

為了探討潛在的C4基因（PEPC）編碼酶在微擬球藻光合固碳中的角色與功能，筆者采用化學抑制劑抑制PEPC酶， 它催化磷酸烯醇式丙酮酸到丙酮酸，即PEPCK酶催化的逆反應。比較微擬球藻、萊茵衣藻的PEPC酶在特異抑制劑作用的情況下，微擬球藻、萊茵衣藻光合作用活性變化。結果表明，槲皮素對萊茵衣藻的PEPC酶作用不明顯，光合放氧速率幾乎沒有發生變化，基本維持在4 μmol/（107個·h）水平，與未處理組沒有顯著差別 （圖6）。對于微擬球藻而言，加入抑制劑后，光合放氧速率從5.5 μmol/（107 個·h）下降至 1.4 μmol/（107 個·h）。可見IMET1的PEPC酶活性顯著被抑制，說明IMET1與萊茵衣藻的PEPC存在不同功能。從圖6可以看出，微擬球藻在黃芩素作用下，光合放氧活性顯著降低，光合作用活性從5 μmol/（107 個·h）降低到1 μmol/（107 個·h）。然而，微擬球藻在蕓香苷水合物抑制試驗中，光合放氧速率幾乎沒有受到影響。添加蕓香苷抑制劑后，萊茵衣藻的光合放氧、光合活性幾乎未受到影響，和對照組相比，處理組的光合放氧速率仍然保持在較高水平，這樣看來微擬球藻、萊茵衣藻的PEPC酶在3個抑制劑作用下表現出不同的特征。通常認為，萊茵衣藻使用C3途徑進行光合CO2固定，因此，筆者推測微擬球藻IMET1可能使用C4循環進行CO2固定。

3 結論

本研究從生理角度和轉錄水平探討了微擬球藻潛在C4的機制，結果表明，微擬球藻IMET1中存在C4光合作用固碳途徑，通過化合物抑制試驗揭示C4途徑中酶在IMET1與萊茵衣藻中可能起不同的功能，特別是在應對逆境過程中起作用， C4基因的表達分析表明，PEPC、PEPCK、ME、PPDK等在藍光脅迫條件下比在正常生長條件下轉錄豐度明顯升高。

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