翹嘴鱖胚胎發育期間酸性和堿性磷酸酶活性的變化

鄒立軍　莊遠紅　龔婧　吉璐　黃美玲

摘要：酸性磷酸酶和堿性磷酸酶作為一種磷酸單酯水解酶，在蛋白（酶）的去磷酸化過程中起著非常重要的作用，研究發現磷酸酶是動物發育過程中物質代謝的重要調控酶。采用磷酸苯二鈉比色法檢測翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）胚胎發育期間酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性變化。結果顯示，胚胎受精后進行細胞分裂時的酸性和堿性磷酸酶活性較低，分別為（0.436±0.051） U/g和（0.061±0.009） U/g，發育至囊胚期時酶活性均有微量下降；而從原腸胚時期開始，酸性和堿性磷酸酶的活性隨胚胎發育的進行呈現上升趨勢，在出膜時期達到最高，分別為（1.076±0.063） U/g和（0.335±0.021） U/g，酶活性顯著增強（P<0.05）。這一結果表明，翹嘴鱖胚胎在原腸胚期合成了磷酸酶，且磷酸酶在胚胎發育期間的細胞增殖、信號傳導和物質代謝等方面可能發揮重要作用。

關鍵詞：翹嘴鱖；胚胎發育；酸性磷酸酶；堿性磷酸酶

中圖分類號： S917 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0287-03

酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）廣泛存在于動物各種組織，是非特異性的磷酸單酯水解酶。它們分別在酸性和堿性條件下起催化作用，直接參與磷酸基團的轉移與代謝，有眾多的催化底物和復雜的生理學功能[1]。其活性與生命活動密切相關，在蛋白（酶）的去磷酸化、調節跨膜運輸及生物體內DNA、蛋白質和脂類等物質代謝中起著重要作用[2，3]。

胚胎期是魚類整個生活史中的一個重要時期，這個時期內魚類依賴其母體提供的營養物質存活，出膜以后則實現了其形態、代謝和生理上的巨大變化，而作為物質代謝過程中的重要調控酶，ACP和AKP在魚類的生長和發育過程中發揮了重要作用。迄今為止，關于水生生物發育過程中磷酸酶的活性變化及表達模式等已開展了相關研究[4-7]，而有關翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）胚胎發育過程中磷酸酶活性變化的研究還未見報道。本研究采用磷酸苯二鈉比色法對翹嘴鱖胚胎發育期間ACP和AKP活性變化進行了定量研究，以期闡明這2種酶在翹嘴鱖發育早期的活性變化規律，進一步掌握翹嘴鱖胚胎發育過程中生理生化的動態變化，為翹嘴鱖的生物學研究積累原始數據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、檸檬酸緩沖液、磷酸苯二鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、4-氨基安替吡林、鐵氰化鉀、硼酸等試劑購于湖南匯虹生物公司。

1.2 主要設備

Nikon Eclipse E200生物顯微鏡，購于日本尼康公司；Biophotometer 核酸蛋白測定儀和Centrifuge 5904離心機，購于德國Eppendorf公司；臺式pH計，購于上海精科公司；島津UV2401型紫外可見光分光光度計，購于日本島津公司。

1.3 試驗材料

用于繁殖的性成熟親魚健康無傷，來自湖南省益陽市水產養殖場。人工授精后，獲取翹嘴鱖受精卵，隨機分組，每組大約500粒，置于含曝氣水的培養皿中。每組設3個平行，試驗期間水溫控制在（20±2） ℃，靜水孵化，換水1次/h以保證溶氧充足。胚胎各發育階段劃分參照劉筠的胚胎發育觀察方法[8]，即所有魚卵必須半數以上達到某個時期才能確定為到達該時期。胚胎發育過程中，及時清除未受精卵和異常胚胎。對受精卵、桑椹胚期、囊胚期、原腸胚期、神經胚期、視泡出現期、肌肉效應期、心跳期、耳石出現期、出膜前期、出膜期共11個發育時期分別取樣。

1.4 樣品制備

每組分別取受精卵120粒，用濾紙吸干水分，在電子天平上稱質量后置于干燥的離心管中，貯存于-80 ℃冰箱備用。制樣時，按質量體積比1 ∶ 4（g/mL）加入生理鹽水，冰浴勻漿；4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，取上清液，分裝儲存于冰箱-20 ℃保存待測，用于測定酶活性的樣本在4 ℃下存放不超過1 h。

1.5 勻漿粗提液蛋白定量

酶液中可溶性蛋白含量測定采用Bradford（考馬斯亮藍）方法[9]，樣本于595 nm下測定吸光度，以牛血清白蛋白（BSA）作為標準蛋白。

1.6 ACP和AKP活性測定

ACP和AKP活性測定采用磷酸苯二鈉比色法[10]，510 nm 下測定吸光度。ACP和AKP活性測定緩沖液pH值分別為4.9和10。酶比活力單位的定義為：37 ℃下，反應體系中1 mg/min蛋白酶產生1 μg酚所需的酶量作為1個酶活力單位（U）。

1.7 數據處理

采用Excel 2003和SPSS 13.0統計軟件對數據進行統計分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗組間差異顯著性，以P

2 結果與分析

2.1 ACP活性變化

翹嘴鱖胚胎從受精卵發育至囊胚期，酶活性變化不顯著（P>0.05），其中受精卵時期的酶活性為（0.436±0.051） U/g（圖1）；原腸胚期ACP活性開始增強，發育至出膜前期的時候，酶活性明顯增強，數值為（0.931±0.030） U/g，與前面各發育時期相比差異顯著（P0.05）；繼續發育至出膜前期后ACP活性顯著性升高（P<0.05）；到出膜期，ACP活性已是受精卵時期酶活性的2.5倍?？梢?，翹嘴鱖胚胎從原腸胚發育開始ACP活性隨著發育的進行而升高。

2.2 AKP活性變化

在受精卵階段AKP活性較低，僅為（0.061±0.009） U/g（圖2）；胚胎繼續發育至囊胚期，ACP維持一定活性且有微弱降低的趨勢，但酶活性變化不顯著（P>0.05），隨著胚胎的進一步發育，AKP活性逐漸增高，原腸胚期AKP活性為（0.096±0.014） U/g，顯著高于前面各發育時期（P<0.05）；心跳期后AKP活性增加幅度更大。耳石出現期、出膜前期、出膜期的酶活性，與前面各發育時期相比，顯著提高（Pendprint

3 討論

3.1 翹嘴鱖胚胎發育期間ACP特性及活性變化

ACP定位于溶酶體和內膜系統，在酸性條件下催化磷酸單脂水解，在代謝調節、能量轉化及信號轉導上起重要作用，同時作為溶酶體標志酶，參與生物大分子消化、凋亡或壞死細胞的清除，在免疫功能和維持細胞的正常代謝活動方面發揮著重要作用[11-13]。本研究發現，翹嘴鱖受精卵分裂開始時ACP活性為（0.436±0.051） U/g，發育至囊胚期時為（0.425±0.021） U/g，呈現微量下降的現象，但活性變化不顯著（P>0.05），表明了受精卵在發育早期具有一定的ACP活性，但為受精卵中的母源性酶類，并非合子基因表達的產物；且胚胎早期細胞分裂對磷酸酶的需求無顯著變化。賈玉東等研究發現，大菱鲆（Scophthalmus maximus）繁殖期卵子中含有一定活性的ACP和AKP[14]，說明這2種酶來自母體，在胚胎發育過程中起重要作用。因此，受精卵中儲存的相關酶或mRNA對胚胎發育的啟動具有重要作用，進而為胚胎早期發育中細胞的快速增長及遷移提供保障[15]。而翹嘴鱖胚胎發育到原腸期開始ACP活性為（0.502±0.031） U/g，與之前相比活性有了較大的提高，說明在原腸期合成了ACP，胚胎內酶基因表達開始逐漸增強，合成水解酶，為胚胎的繼續發育提供了保證。朱俊華等研究甌江彩鯉（Diplodus sargus）早期發育過程中的ACP活性時，也發現出膜期的酶活性顯著增加[16]。王書平等研究金魚胚胎發育中ACP的變化也有類似發現[7]。在本研究過程中翹嘴鱖胚胎在出膜前期已有少量的胚胎孵出，而在出膜期幾乎所有胚胎均已孵出，這2個時期ACP活性分別為（0.931±0.030）U/g和（1.076±0.063）U/g，且酶活性顯著增強（P<0.05）。推測出膜以后的仔魚可能由于失去了卵膜的保護而直接與外界環境接觸，需要較高的ACP活性參與生理代謝調控和免疫防護有關，因此誘導了酸性酶活性大幅增加。

3.2 翹嘴鱖胚胎發育期間AKP特性及活性變化

AKP是一類膜結合蛋白，在堿性條件下催化磷酸基團的移除，通過跨膜運輸參與核酸、蛋白質與脂類物質代謝，從而調控細胞的增殖、凋亡和分化，在動物的早期發育時期發揮重要作用[17-18]。本研究中，翹嘴鱖受精卵時期的AKP活性為（0.061±0.009） U/g，且活力處于一個較低的水平，隨著胚胎的發育，母源性mRNA的消耗，AKP在桑椹胚期與囊胚期酶的活性呈下降趨勢，但活性變化不顯著（P>0.05）。而發育至原腸胚期的酶活性為（0.096±0.014）U/g，較前面的發育時期有了顯著增強（P<0.05）；達到出膜期時，AKP活性達到最高，且酶活性顯著增加（P

魚類胚胎發育過程中ACP和AKP的作用較為復雜，其活性變化也受外源性激素、重金屬元素和溫度等多種因素影響，不同種間也存在一定的差異。本試驗發現，翹嘴鱖胚胎從受精卵開始發育至囊胚期磷酸酶降至較低水平后，于原腸胚期有了較大的提高，說明在原腸胚期合成了磷酸酶，胚胎內酶基因開始表達并合成水解酶，隨著胚胎的進一步發育，磷酸酶活性顯著增強，這標志著翹嘴鱖由胚胎期向仔魚期的轉變及生理機能的完善。同時，研究發現受精卵時期的母源性ACP的活性要顯著高于AKP，因此推測ACP很可能參與了調控卵母細胞的成熟。這些工作為進一步確定磷酸酶在魚類受精過程和胚胎發育中的功能提供了新的理論依據。

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