天山北坡奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定

康立超　盧春霞　劉長彬

摘要：對分布于天山北坡的4個集約化奶牛場進行了乳房炎發(fā)病情況和病原學研究。結(jié)果顯示，通過對300頭產(chǎn)奶牛和1 162份奶樣的檢測，發(fā)現(xiàn)臨床乳房炎頭數(shù)陽性率為11.2%，乳區(qū)陽性率為8.0%，主要病原菌有無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和少動鞘氨醇單胞菌，均有較高的耐藥性。隱性乳房炎頭數(shù)陽性率為73.24%，乳區(qū)陽性率為42.91%，病原菌較雜（少動鞘氨醇單胞菌、溶血葡萄球菌、陰道加特納菌、西宮皮球菌、坐皮膚球菌、口腔鏈球菌/緩癥鏈球菌、產(chǎn)硫球鏈菌、玫瑰色庫克菌、奈瑟菌），對常見抗生素有敏感性。由以上結(jié)果可見，天山北坡集約化牛場臨床型乳房炎和隱性乳房炎的發(fā)病率較高，且臨床型乳房炎致病菌對抗生素均有較高的耐藥性。

關(guān)鍵詞：奶牛；乳房炎；病原菌；分離鑒定

中圖分類號： S858.237.2+6 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0271-04

奶牛乳房炎是奶牛的一種常見多發(fā)性疾病，發(fā)生乳房炎的奶牛產(chǎn)奶量下降，牛奶品質(zhì)降低，干擾正常繁殖機能，病情嚴重時造成奶牛患病乳區(qū)廢棄、失去泌乳能力而被淘汰，造成巨大的經(jīng)濟損失。引起奶牛乳房炎的因素很多，可由創(chuàng)口、環(huán)境微生物、傳染性微生物等引起，其中傳染性病原微生物引起的乳房炎最為常見，危害最大[1]。奶牛乳房炎的病原體有80～130種，其中主要為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、霉形體、乳房鏈球菌、大腸桿菌、化膿桿菌等。據(jù)調(diào)查，無癥狀的隱性乳房炎發(fā)病率更高，約占整個牛群的50%，其中約90%由鏈球菌和葡萄球菌引起[2]。本試驗針對天山北坡地區(qū)的4個奶牛場進行了乳房炎的調(diào)查和病原的分離與鑒定，以期找出導致該地區(qū)奶牛乳房炎的主要致病菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 來自天山北坡養(yǎng)牛經(jīng)濟帶的4個奶牛場的300頭產(chǎn)奶牛乳樣。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基，BHI培養(yǎng)基，普通營養(yǎng)瓊脂，購自杭州微生物試劑有限公司；奶牛隱性乳房炎臨床診斷（CMT）試劑，購自北京福茂大地商貿(mào)有限公司。

1.1.3 儀器 VITEK-2全自動生化鑒定儀，精密恒溫培養(yǎng)箱，乳品分析儀（Lactoscan 5557），體細胞計數(shù)儀（Nucleo Counter SCC-100）。

1.2 方法

1.2.1 奶樣的采集及分析 分別從4個奶牛場的擠奶廳里，隨機確定采樣奶牛。先用溫水拭凈采樣乳區(qū)皮膚，再用75%乙醇消毒，采用無菌操作擠奶，棄去頭3把奶，用無菌瓶分別收集4個乳區(qū)的乳樣，每個乳區(qū)采集約30 mL，低溫冷藏保存，4 h內(nèi)送回實驗室進行乳品品質(zhì)分析和體細胞計數(shù)。

1.2.2 乳房炎的檢測 在乳樣采集時，先用溫水擦洗奶牛乳房，擦洗過程中注意觀察乳房是否有不同程度的充血、腫脹、發(fā)硬、發(fā)熱，尤其觀察是否有疼痛感。若有以上癥狀，在擠奶過程中要特別注意，并記錄牛號，觀察乳汁有無變稀薄，且有無絮狀物或凝塊，以及膿汁和血液，若有以上癥狀并結(jié)合乳房變化判定為臨床乳房炎。如果眼觀無明顯變化，則在反應(yīng)盤留取奶樣2 mL左右，加入等量的CMT診斷液，緩慢搖動，使奶樣與診斷液充分混合，觀察凝集現(xiàn)象并記錄結(jié)果，按CMT判定標準對每個檢樣進行判定是否為隱性乳房炎。

1.2.3 細菌的分離培養(yǎng)和染色鏡檢 將判定為臨床乳房炎的10份乳樣（L1至L10）和隱性乳房炎的10份乳樣（Y1至Y10），分別取0.1 mL均勻涂布于5%綿羊鮮血瓊脂平板上，放入37 ℃溫箱中培養(yǎng)24～48 h。培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)基上有無菌落生長，觀察在不同培養(yǎng)基上所形成單個菌落的形態(tài)特征、溶血及生長情況等，對不同形態(tài)的菌落進行涂片、染色、鏡檢。在鮮血平板上生長的菌落形態(tài)特征、溶血及生長情況等一致，染色鏡檢結(jié)果相同的暫歸為同一種菌；在同一個平板上同一病料初次接種生長的同一種菌，菌苔和菌落數(shù)量明顯較多的歸為優(yōu)勢菌株。

1.2.4 生化鑒定 分離到的不同種類的細菌，根據(jù)革蘭氏染色情況，革蘭氏陽性菌上GP生化鑒定卡，革蘭氏陰性菌上GN生化鑒定卡。按照VITEK-2說明書操作進行生化鑒定。

1.2.5 藥敏試驗 將純化優(yōu)勢菌株的單菌落接種到BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，用滅菌棉簽均勻涂布于5%綿羊鮮血平板上，再分別貼上藥敏紙片37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察對常用獸藥（阿奇霉素、頭孢噻肟鈉、氨芐西林鈉、慶大霉素、氧氟沙星、泰樂菌素、克林霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、鏈霉素、青霉素G）的敏感性（藥敏紙片藥品含量與判定標準參考杭州天和微生物試劑有限公司）。

2 結(jié)果與分析

2.1 調(diào)查概況

本試驗共采集300頭產(chǎn)奶牛的1 162份乳樣，其中有38個乳區(qū)瞎。其中，臨床乳房炎陽性的乳樣，由于奶性質(zhì)變化較大，未檢測乳品品質(zhì)和體細胞計數(shù)。經(jīng)檢測，奶牛生鮮乳平均體細胞在78.06萬/mL，非脂乳固體為7.75 g/100 g（國家限量標準為≥8.1 g/100 g），密度1.026 g/mL 20 ℃/4 ℃（國家限量標準為≥1.027），蛋白質(zhì)為2.86 g/100 g（國家限量標準為≥2.8 g/100 g），脂肪為4.28 g/100 g（國家限量標準為≥3.1 g/100 g），冰點為-0.48 ℃（國家限量標準為-0.5～-0.56 ℃），雜質(zhì)度為2.5 mg/L（國家限量標準為≤4.0 mg/L），礦物質(zhì)為0.73 g/100 g。

2.2 奶牛乳房炎發(fā)病率

通過對300頭產(chǎn)奶牛臨床診斷和乳汁變化分析，臨床乳房炎結(jié)果按乳區(qū)計算的發(fā)病率為8.0%，按牛頭數(shù)計算為11.2%。用CMT法檢測隱性乳房炎發(fā)病率，按乳區(qū)計算為42.81%，按牛頭數(shù)計算為73.24%。

2.3 細菌的分離鑒定

通過對20份乳樣的細菌培養(yǎng)，10份臨床乳房炎乳樣品中，培養(yǎng)均發(fā)現(xiàn)有病原菌存在，根據(jù)菌落的形態(tài)特征、溶血和染色鏡檢情況等挑選分離得到8株細菌（A1至A8）；隱性乳房炎的10份乳樣，在5%綿羊鮮血平板培養(yǎng)有8份發(fā)現(xiàn)有細菌生長，2份未發(fā)現(xiàn)任何細菌生長，根據(jù)菌落的形態(tài)特征、溶血和染色鏡檢情況等挑選分離得到10株細菌（B1至B10）。將分離到的18株菌，根據(jù)革蘭氏染色情況，用VITEK-2 Compact鑒定出10種不同的細菌（表1），主要有：無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、少動鞘氨醇單胞菌、溶血葡萄球菌、陰道加特納菌、西宮皮球菌/坐皮膚球菌、口腔鏈球菌/緩癥鏈球菌、產(chǎn)硫球鏈菌、玫瑰色庫克菌、奈瑟菌。少動鞘氨醇菌在臨床乳房炎和隱性乳房炎乳樣中都被分離到。臨床乳房炎乳樣中還分離到無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌，其他菌均只在隱性乳房炎乳樣中分離到。通過表2細菌分布情況可以看出，臨床乳房炎中無乳鏈球菌占70%、金黃色葡萄球菌占80%和少動鞘氨醇單胞菌占50%，為主要優(yōu)勢病原菌。隱性乳房炎中少動鞘氨醇單胞菌占40%，溶血葡萄球菌占30%，西宮皮球菌/坐皮膚球菌占30%，口腔鏈球菌/緩癥鏈球菌占40%，玫瑰色庫克菌、產(chǎn)硫球鏈菌、陰道加特納菌和奈瑟菌各占10%。因此，病原菌較復雜，沒有明顯的優(yōu)勢病原菌。endprint

2.5 藥敏試驗

金黃色葡萄球菌全部耐藥，無乳鏈球菌對青霉素有敏感性，少動鞘氨醇單胞菌對慶大霉素和氧氟沙星有敏感性，溶血葡萄球菌對氧氟沙星和恩諾沙星有敏感性，玫瑰色庫克菌對青霉素、阿奇霉素、克林霉素、慶大霉素、氧氟沙星、氟苯尼考和頭孢噻肟鈉等敏感，陰道加特納菌對頭孢噻肟鈉、克林霉素、氨芐西林鈉、氧氟沙星、阿奇霉素和慶大霉素等有敏感性。

3 討論

本試驗中檢測乳房炎的發(fā)病率非常高，隱性乳房炎頭數(shù)陽性率可達73.24%，乳區(qū)陽性率達42.91%，比2008年李建軍報道新疆集約化牛場隱性乳房炎頭數(shù)陽性率為64.75%、乳區(qū)陽性率為36.6%有所增加。近幾年規(guī)模化養(yǎng)殖都有合理、配套的管理程序和規(guī)范，以及先進配料和擠奶設(shè)備，為什么乳房炎的發(fā)病率有增無減呢？筆者采樣時發(fā)現(xiàn)，在本試驗采樣中近10%臨床乳房炎陽性牛，發(fā)病乳區(qū)所產(chǎn)的乳汁明顯不正常，但這樣的牛仍然出現(xiàn)在擠奶廳里，并且這樣的乳區(qū)還在正常機械化擠奶。患有乳房炎的牛繼續(xù)擠奶，除擠奶工本身的問題外，還有監(jiān)管的問題。因此，要加大對擠奶人員的技術(shù)培訓，提高專業(yè)素質(zhì)；嚴格監(jiān)管，提高責任心；嚴格按擠奶程序進行規(guī)范操作；及時檢查奶牛個體情況，及早發(fā)現(xiàn)隱性乳房炎給予治療；患乳房炎的奶牛嚴禁上廳擠奶，防止交叉感染。

如此高的乳房炎發(fā)病率嚴重影響奶牛生鮮乳的品質(zhì)。本試驗中生鮮乳品質(zhì)分析，蛋白質(zhì)含量為2.87 g/100 g，雖然達到了我國最新奶業(yè)安全標準2.8 g/100 g， 但遠低于發(fā)達國家氨醇單胞菌；B9、B10：奈瑟菌

3.0 g/100 g以上的標準，與歐美國家有很大差距。非脂乳固體為7.69 g/100 g，未達到國家標準的8.1 g/100 g，密度為1.026 g/mL，也未達到國家標準的1.027 g/mL。通過比較發(fā)現(xiàn)，我國生鮮乳品質(zhì)與歐美國家還有很大差距，因此，提高奶牛的飼喂營養(yǎng)水平，加強乳品質(zhì)投入品的質(zhì)量；改善飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生條件，嚴格控制和預防乳房炎的同時，也需要社會各界對奶牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供支持和幫助。

我國生鮮乳檢測標準中還未將體細胞數(shù)列入檢測指標。但國際奶牛聯(lián)合會規(guī)定，體細胞數(shù)在20萬～40萬/mL為隱型乳房炎，50萬/mL以上為臨床型乳房炎[3]。目前我國也只有三元、光明、伊利等少數(shù)幾家大型乳業(yè)公司在收購原料奶的時候要求控制體細胞數(shù)， 一般的要求是≤60萬/mL[3]。本試產(chǎn)硫球鏈菌；i：奈瑟菌；j：陰道加特納菌。

驗檢測平均生鮮乳體細胞在78.06萬/mL，這也進一步反映了奶牛乳房炎的嚴重性。如果按照體細胞數(shù)大于60萬/mL為乳房炎計算，頭數(shù)乳房炎陽性率可達60.56%，乳區(qū)乳房炎陽性率達25.82%。控制體細胞的關(guān)鍵是控制乳房炎的發(fā)病率。在國外乳業(yè)發(fā)達國家，體細胞數(shù)是必檢指標，并且都有強制的規(guī)定，比如歐盟、澳大利亞、新西蘭要求不超過40萬/mL，美國要求不超過75萬/mL。生鮮牛奶中平均體細胞數(shù)限量最低的國家是瑞士，約為10萬/mL[4]。因此我國的牛奶體細胞數(shù)控制歷程還很嚴峻。

本試驗對10份有明顯癥狀的臨床乳房炎的乳樣進行細菌分離，10份乳樣均檢出細菌，細菌的檢出率為100%。根據(jù)菌落形態(tài)分離到8株菌，鑒定為無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和少動鞘氨醇單胞菌3種菌。對10份經(jīng)CMT檢測陽性的隱性乳房炎的乳樣進行細菌分離，8份乳樣檢出細菌，細菌的檢出率為80%。而2份未分離到細菌，可能是因為該隱性乳房炎病原可能是支原體、衣原體或病毒等較難培養(yǎng)的微生物引起。根據(jù)菌落形態(tài)分離到10株菌，鑒定為8種菌。臨床乳房炎為乳房炎發(fā)病后期，病原菌較單一，為常見優(yōu)勢病原菌，而隱性乳房炎分離到細菌較復雜，沒有特定的優(yōu)勢菌。金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌是報道的常見乳房炎病原菌。本試驗從隱性乳房炎中分離到的少動鞘氨醇單胞菌[5-6]、溶血葡萄球菌[7-8]、玫瑰色庫克菌[9-10]、奈瑟菌[11]、陰道加特納菌[12]均有致病性的報道。雖然由于細菌生化鑒定儀VITEK-2 Compact 對口腔鏈球菌和緩癥鏈球菌、西宮皮球菌和坐皮膚球菌兩兩不能區(qū)分菌種，但西宮皮球菌[13]、口腔鏈球菌和緩癥鏈球菌[14]也有相關(guān)的致病性報道。坐皮膚球菌和產(chǎn)硫球鏈菌相關(guān)文獻較少，是否有致病性，還有待進一步驗證。

藥敏試驗結(jié)果顯示，臨床乳房炎病原菌由于長期使用抗生素治療，產(chǎn)生很強的耐藥性，而隱性乳房炎分離菌對大多數(shù)抗生素有敏感性，在早期治療過程中有很好的借鑒作用。文獻報道中隱性乳房炎病原菌主要有金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等[15-17]。本試驗分離到隱性乳房炎細菌與報道的差異很大。可能是本試驗確定的隱性乳房炎更接近發(fā)病初期，因此，所分離到的細菌均為醫(yī)院報道病原菌，在發(fā)展到臨床型乳房炎時被致病性更強的如金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等所取代。本試驗在臨床乳房炎中分離到金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌，但未分離到大腸桿菌，也可能是由于本試驗樣品量較少所致。

參考文獻：

[1]劉福榮，王守君，任仲麗，等. 奶牛乳房炎的病因與診治[J]. 養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2013（11）：96.

[2]王傳蓉.奶牛乳房炎的病原體[J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘，2013，29（12）：132，133.

[3] 云南省昆明數(shù)字鄉(xiāng)村新農(nóng)村建設(shè)信息網(wǎng). 各國對牛奶中體細胞數(shù)（SCC）的規(guī)定[EB/OL].[2014-09-12]. http：//www.ynszxc.gov.cn/S1/S2/C8507/DV/20130927/4302945.shtml.

[4]周承剛.牛奶體細胞檢測和控制的昨天、今天和明天[J]. 今日畜牧獸醫(yī)：奶牛，2012（10）：79-80.

[5]凌應(yīng)培.從血液中檢出少動鞘氨醇單胞菌1例[J]. 臨床檢驗雜志，2010，28（1）：73.

[6]來漢江，楊莉俊，周鴻亮，等. 116例少動鞘氨醇單胞菌的醫(yī)院感染及耐藥特點[J]. 中華醫(yī)院感染學雜志，2010，20（4）：581-583.

[7]馬巧紅，陳群英.286株溶血葡萄球菌的臨床分布及藥敏分析[J]. 中國微生態(tài)學雜志，2013，25（9）：1079-1081.

[8]吳康明.32株溶血葡萄球菌感染分布及耐藥性監(jiān)測[J]. 安徽醫(yī)藥，2013，17（1）：101-102.

[9]楊 銳.玫瑰色庫克菌致手深部感染1例[J]. 臨床檢驗雜志，2010，8（3）：174.

[10]李世榮，王 紅，任愛民，等. 玫瑰色庫克菌致正常免疫力成人敗血癥1例[J]. 中國醫(yī)刊，2013，48（2）：109-110.

[11]劉鳳芹，黃 艷.2012年某院淋病奈瑟菌感染調(diào)查[J]. 中國感染控制雜志，2014，13（3）：189-190.

[12]張玉華.陰道加特納菌的致病性分析[J]. 檢驗醫(yī)學與臨床，2011，8（9）：1125-1126.

[13]杜宏波，史卓敏，盧聯(lián)合.西宮皮球菌相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染一例[J]. 中華實驗和臨床感染病雜志：電子版，2010，4（3）：323-326.

[14]王虎軍，畢 磊，顧紅燕.緩癥鏈球菌感染的抗生素治療[J]. 浙江臨床醫(yī)學，2013，15（8）：1166-1168.

[15]王海軍，芮 藝，昌莉麗，等. 徐州地區(qū)奶牛隱性乳房炎病原調(diào)查及藥物敏感性檢測[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2012，44（12）：79-82.

[16]李建軍，楊學云，王治才，等. 新疆集約化奶牛場隱性乳房炎流行病學和病原學研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學，2008，45（2）：369-373.

[17]李樹梅，張海峰，盧勝明.河北地區(qū)隱性乳房炎的流行病學調(diào)查[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（1）：90-92.楊尚雪，李 珣，王曉曄，等. 水蛭素對冷凍前后豬精液中超氧化物歧化酶活性及mRNA表達的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（10）：275-278.endprint