非洲紫羅蘭原生質體制備條件優化

郭愛華

摘要：以苗齡為15 d的非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha Wendl）幼苗頂端2片完全伸展的葉片為材料，從酶濃度、酶配比、時間、溫度、滲透壓等方面設置試驗，研究制備非洲紫羅蘭原生質體的條件，最終得出1組制備其原生質體的良好條件，即酶組合為1.5%纖維素酶+0.5%果膠酶，酶解時間為3 h，酶液滲透壓即甘露醇濃度為0.6 mol/L，溫度為25 ℃，在此條件下可分離出大量有活力的原生質體。

關鍵詞：非洲紫羅蘭；原生質體；制備；優化

中圖分類號： S681.203 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0230-03

非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha Wendl），原產于東非熱帶地區，多年生草本植物，苦苣苔科非洲堇屬，別名非洲堇。其植株是適合室內盆栽的優良花卉，花色斑斕、玲瓏小巧、四季開花。20世紀80年代中國才從歐美地區引種試管苗。目前，僅少數園藝公司擁有小批量生產技術，國內非洲紫羅蘭在品種創新、生產規模化、基因多樣性及穩定性等研究方面都受到較大制約。隨著經濟飛速發展，人民生活水平和品味的提高，人們對居家環境的要求也顯著增高，非洲紫羅蘭作為兼具優良觀賞功能與環境凈化功能的花卉品種，備受消費者歡迎，市場前景廣闊[1]。

原生質體是除去細胞壁的植物細胞，其細胞膜較薄，適用于生物工程，是創造新品種和進行基因遺傳改良的理想材料，是在細胞水平上進行植物人工育種和栽培體系的有效方法，是提高產業化、規?；降挠行緩絒1-3]。探討非洲紫羅蘭原生質體的制備，為進一步研究其基因表達及培育新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

非洲紫羅蘭（混色）種子購于北京鑫農豐農業技術研究所。

1.2 幼苗培養及試驗方法

1.2.1 幼苗培養 將種子用0.1%氯化汞表面消毒后置于培養皿中水培15 d，剪取無菌苗頂端2片完全伸展的葉片，蒸餾水沖洗干凈，用雙面刀片將其切成1～2 mm的小碎塊。

1.2.2 標準液的配制 非洲紫羅蘭幼苗培養標準液配制見表1。

1.2.3 原生質體的制備 纖維素酶（cellulase R-10）濃度有1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，果膠酶（pectinase Y-23）濃度有0%、0.5%、1.5%、2.0%，分別制成16種不同濃度的混合酶溶解于配有0.4 mol/L甘露醇的標準液中，將pH值調至5.6。酶解非洲紫羅蘭幼苗以確定纖維素酶和果膠酶對原生質體制備的影響。每次取0.5 g 1～2 mm葉片小碎塊，置于試管，加入5 mL的酶解液，25 ℃生化培養箱解離2 h，60 r/min 搖床黑暗條件下解離2 h。酶解后經280目尼龍網篩過濾除去細胞團濾液與未酶解完全的組織。

1.2.4 原生質體產量及活力測定 原生質體的產量計算參考張曉可等方法[4]；原生質活力的測定采用參考文獻[1]的方法。以原生質體產量及原生質體活力確定最佳酶配比。

1.2.5 酶解時間與原生質體分離 設1、2、3、4、5 h共5個時間處理，即將葉片轉入加有最佳酶組合的酶解液中解離上述時間后再置于60 r/min搖床上黑暗條件下解離2 h，比較酶解時間對制備非洲紫羅蘭原生質體的影響。

1.2.6 甘露醇與原生質體分離 將葉片加入到前面選取的最佳酶解液中，分別加入甘露醇0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L共4個處理，用所選取的最佳時間進行解離，比較不同滲透壓對原生質體制備的影響。

1.2.7 酶解溫度與原生質體分離 依據試驗獲得的最佳酶解條件，設置4個溫度處理，分別為23、25、27、30 ℃。根據原生質體數量及活力比較4個溫度條件下對非洲紫羅蘭原生質體制備的影響。

2 結果與分析

2.1 酶組合及配比對原生質體制備的影響

影響原生質體分離的因素較多，但酶類組合及濃度大小是影響原生質體分離的主要因素之一，不同的酶組合對原生質體產量和活力影響不同[5]。本試驗采用不同濃度的纖維素酶R-10和果膠酶Y-23進行組合研究，根據非洲紫羅蘭原生質體產量和活力得出最佳酶配比，從表2可以看出，酶解液中只加纖維素酶R-10時，原生質體產量較少，且原生質體的產量隨著纖維素酶R-10含量的增加明顯增加，當纖維素酶R-10含量超過2%時，原生質體的產量有所下降；在酶解液中同時加入果膠酶Y-23時原生質體產量增加，但當其含量超過1%時，原生質體的產量降低。從活力來看，組合酶濃度低時非洲紫羅蘭原生質體的活力較高，隨著組合酶酶濃度的增加，其原生質體活力有所下降。因此，酶液組合為1.5%維素酶R-10+0.5%果膠酶Y-23時對制備非洲紫羅蘭葉片原生質體較適合。

2.2 酶解時間對原生質體制備的影響

時間過短，原生質體產量低，時間過長則導致原生質體中毒或破裂[6-7]。本試驗在確定了最佳酶解組合后，在此條件下分析了不同的酶解時間對非洲紫羅蘭原生質體的制備影響，從圖1可以看出，隨酶解時間的推移原生質體的產量先迅速提升后再下降；從圖2可以看出，原生質體活力的變化也為先升高后降低。酶解3 h時原生質體產量和活力均達到最大值，經分析與其他條件下的產量（|t3，4|=7.76，P<0.01）和活力（|t3，4|=7.85，P

2.3 滲透壓對原生質體制備的影響

原生質體分離過程中，常加入一些藥品如甘露醇、蔗糖、山梨醇、葡萄糖等作為滲透壓穩定劑，不同植物材料所要求的酶液滲透壓不盡相同[6-7]，因此，適宜濃度的滲透壓穩定劑對原生質體的穩定和產出具有重要意義[7]。本試驗選擇甘露醇作為制備原生質體的滲透壓穩定劑，在酶解液中分別添加0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L的甘露醇，酶解3 h，原生質體產量與活力的測定結果見表3。甘露醇濃度從0.2 mol/L上升后，非洲紫羅蘭原生質體的產量和活力也隨之升高；濃度為 0.6 mol/L 時，其產量和活力均達到最大值，經分析產量與其他條件相比差異極顯著（|t0.6，0.8|=11.2，Pendprint

2.4 溫度對原生質體制備的影響

溫度對非洲紫羅蘭原生質體的制備影響也較大。從圖3可以看出，在所選取的溫度范圍內，開始時隨著溫度升高，原生質體產量逐漸上升，當溫度為25 ℃時，原生質體的產量達到最高值，溫度為25、27 ℃條件下，二者的產量差異極顯著（|t25，27|=7.21，P

3 討論

影響原生質體制備的條件因素非常多，如木本或草本材料、對材料的預處理、pH值、酶的構成及配比、酶解的溫度、酶解的時間、滲透壓等[9-10]，每一種條件的細微變化都會影響原生質體的制備，使獲得的原生質體產量和活力不同。本研究主要從酶濃度、酶配比、時間、溫度以及滲透壓等方面設置試驗探討制備非洲紫羅蘭原生質體的條件，最終得出一組制備其原生質體的最適條件：即1.5%纖維素酶+0.5%果膠酶，酶解時間為3 h，甘露醇濃度為0.6 mol/L，溫度為25 ℃，在此條件下可分離出大量有活力的原生質體。此結果為非洲紫羅蘭的基因遺傳研究、培育新品種及物種多樣性提供了理論基礎。

參考文獻：

[1]陳 鑫，李 駿，余汝媛，等. 非洲紫羅蘭原生質體的制備及不同組分培養基對細胞增殖的影響[J]. 廣東藥學院學報，2012，28（5）：497-501.

[2]王 莉，姚占軍. 植物原生質體的制備與活力檢測研究進展[J]. 生物技術通報，2009（增刊）：46-50.

[3]張曉可，於丙軍. 大豆幼苗根和葉片原生質的分離與純化[J]. 大豆科學，2009，28（4）：697-701.

[4]楊 茹，劉世琦，張自坤，等. 大蒜原生質體游離和純化的研究[J]. 中國農學通報，2010，26（4）：195-199.

[5]Duquenne B，Eeckhaut T，Werbrouck S，et al. Effect of enzyme concentrations on protoplast isolation and protoplast culture of Spathiphyllum and Anthurium[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2007，91（2）：165-173.

[6]羿德磊，王海朋，崔為正，等. 桑樹原生質體分離條件的優化試驗[J]. 蠶業科學，2012，38（2）：204-209.

[7]李玉珠，陶 茸，王 娟，等. 百脈根原生質體的分離和酶解條件的研究[J]. 草地學報，2010，18（6）：798-804.

[8]蔡 肖，康向陽. 小青楊葉肉原生質體分離條件的研究[J]. 中國農學通報，2011，27（10）：18-22.

[9]邢朝斌，沈海龍，趙星宇，等. 刺五加幼葉原生質體的分離法[J]. 植物生理學通訊，2006，42（2）：288-290.

[10]楊光梅，杜春蕾，黃曉華，等. 辣根葉片原生質體分離條件的研究[J]. 種子，2010，29（2）：48-51.endprint