非洲紫羅蘭原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化

郭愛華

摘要：以苗齡為15 d的非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha Wendl）幼苗頂端2片完全伸展的葉片為材料，從酶濃度、酶配比、時間、溫度、滲透壓等方面設(shè)置試驗，研究制備非洲紫羅蘭原生質(zhì)體的條件，最終得出1組制備其原生質(zhì)體的良好條件，即酶組合為1.5%纖維素酶+0.5%果膠酶，酶解時間為3 h，酶液滲透壓即甘露醇濃度為0.6 mol/L，溫度為25 ℃，在此條件下可分離出大量有活力的原生質(zhì)體。

關(guān)鍵詞：非洲紫羅蘭；原生質(zhì)體；制備；優(yōu)化

中圖分類號： S681.203 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0230-03

非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha Wendl），原產(chǎn)于東非熱帶地區(qū)，多年生草本植物，苦苣苔科非洲堇屬，別名非洲堇。其植株是適合室內(nèi)盆栽的優(yōu)良花卉，花色斑斕、玲瓏小巧、四季開花。20世紀80年代中國才從歐美地區(qū)引種試管苗。目前，僅少數(shù)園藝公司擁有小批量生產(chǎn)技術(shù)，國內(nèi)非洲紫羅蘭在品種創(chuàng)新、生產(chǎn)規(guī)模化、基因多樣性及穩(wěn)定性等研究方面都受到較大制約。隨著經(jīng)濟飛速發(fā)展，人民生活水平和品味的提高，人們對居家環(huán)境的要求也顯著增高，非洲紫羅蘭作為兼具優(yōu)良觀賞功能與環(huán)境凈化功能的花卉品種，備受消費者歡迎，市場前景廣闊[1]。

原生質(zhì)體是除去細胞壁的植物細胞，其細胞膜較薄，適用于生物工程，是創(chuàng)造新品種和進行基因遺傳改良的理想材料，是在細胞水平上進行植物人工育種和栽培體系的有效方法，是提高產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化水平的有效途徑[1-3]。探討非洲紫羅蘭原生質(zhì)體的制備，為進一步研究其基因表達及培育新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

非洲紫羅蘭（混色）種子購于北京鑫農(nóng)豐農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所。

1.2 幼苗培養(yǎng)及試驗方法

1.2.1 幼苗培養(yǎng) 將種子用0.1%氯化汞表面消毒后置于培養(yǎng)皿中水培15 d，剪取無菌苗頂端2片完全伸展的葉片，蒸餾水沖洗干凈，用雙面刀片將其切成1～2 mm的小碎塊。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制 非洲紫羅蘭幼苗培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)液配制見表1。

1.2.3 原生質(zhì)體的制備 纖維素酶（cellulase R-10）濃度有1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，果膠酶（pectinase Y-23）濃度有0%、0.5%、1.5%、2.0%，分別制成16種不同濃度的混合酶溶解于配有0.4 mol/L甘露醇的標(biāo)準(zhǔn)液中，將pH值調(diào)至5.6。酶解非洲紫羅蘭幼苗以確定纖維素酶和果膠酶對原生質(zhì)體制備的影響。每次取0.5 g 1～2 mm葉片小碎塊，置于試管，加入5 mL的酶解液，25 ℃生化培養(yǎng)箱解離2 h，60 r/min 搖床黑暗條件下解離2 h。酶解后經(jīng)280目尼龍網(wǎng)篩過濾除去細胞團濾液與未酶解完全的組織。

1.2.4 原生質(zhì)體產(chǎn)量及活力測定 原生質(zhì)體的產(chǎn)量計算參考張曉可等方法[4]；原生質(zhì)活力的測定采用參考文獻[1]的方法。以原生質(zhì)體產(chǎn)量及原生質(zhì)體活力確定最佳酶配比。

1.2.5 酶解時間與原生質(zhì)體分離 設(shè)1、2、3、4、5 h共5個時間處理，即將葉片轉(zhuǎn)入加有最佳酶組合的酶解液中解離上述時間后再置于60 r/min搖床上黑暗條件下解離2 h，比較酶解時間對制備非洲紫羅蘭原生質(zhì)體的影響。

1.2.6 甘露醇與原生質(zhì)體分離 將葉片加入到前面選取的最佳酶解液中，分別加入甘露醇0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L共4個處理，用所選取的最佳時間進行解離，比較不同滲透壓對原生質(zhì)體制備的影響。

1.2.7 酶解溫度與原生質(zhì)體分離 依據(jù)試驗獲得的最佳酶解條件，設(shè)置4個溫度處理，分別為23、25、27、30 ℃。根據(jù)原生質(zhì)體數(shù)量及活力比較4個溫度條件下對非洲紫羅蘭原生質(zhì)體制備的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶組合及配比對原生質(zhì)體制備的影響

影響原生質(zhì)體分離的因素較多，但酶類組合及濃度大小是影響原生質(zhì)體分離的主要因素之一，不同的酶組合對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力影響不同[5]。本試驗采用不同濃度的纖維素酶R-10和果膠酶Y-23進行組合研究，根據(jù)非洲紫羅蘭原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力得出最佳酶配比，從表2可以看出，酶解液中只加纖維素酶R-10時，原生質(zhì)體產(chǎn)量較少，且原生質(zhì)體的產(chǎn)量隨著纖維素酶R-10含量的增加明顯增加，當(dāng)纖維素酶R-10含量超過2%時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量有所下降；在酶解液中同時加入果膠酶Y-23時原生質(zhì)體產(chǎn)量增加，但當(dāng)其含量超過1%時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量降低。從活力來看，組合酶濃度低時非洲紫羅蘭原生質(zhì)體的活力較高，隨著組合酶酶濃度的增加，其原生質(zhì)體活力有所下降。因此，酶液組合為1.5%維素酶R-10+0.5%果膠酶Y-23時對制備非洲紫羅蘭葉片原生質(zhì)體較適合。

2.2 酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響

時間過短，原生質(zhì)體產(chǎn)量低，時間過長則導(dǎo)致原生質(zhì)體中毒或破裂[6-7]。本試驗在確定了最佳酶解組合后，在此條件下分析了不同的酶解時間對非洲紫羅蘭原生質(zhì)體的制備影響，從圖1可以看出，隨酶解時間的推移原生質(zhì)體的產(chǎn)量先迅速提升后再下降；從圖2可以看出，原生質(zhì)體活力的變化也為先升高后降低。酶解3 h時原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力均達到最大值，經(jīng)分析與其他條件下的產(chǎn)量（|t3，4|=7.76，P<0.01）和活力（|t3，4|=7.85，P

2.3 滲透壓對原生質(zhì)體制備的影響

原生質(zhì)體分離過程中，常加入一些藥品如甘露醇、蔗糖、山梨醇、葡萄糖等作為滲透壓穩(wěn)定劑，不同植物材料所要求的酶液滲透壓不盡相同[6-7]，因此，適宜濃度的滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體的穩(wěn)定和產(chǎn)出具有重要意義[7]。本試驗選擇甘露醇作為制備原生質(zhì)體的滲透壓穩(wěn)定劑，在酶解液中分別添加0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L的甘露醇，酶解3 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力的測定結(jié)果見表3。甘露醇濃度從0.2 mol/L上升后，非洲紫羅蘭原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力也隨之升高；濃度為 0.6 mol/L 時，其產(chǎn)量和活力均達到最大值，經(jīng)分析產(chǎn)量與其他條件相比差異極顯著（|t0.6，0.8|=11.2，Pendprint

2.4 溫度對原生質(zhì)體制備的影響

溫度對非洲紫羅蘭原生質(zhì)體的制備影響也較大。從圖3可以看出，在所選取的溫度范圍內(nèi)，開始時隨著溫度升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸上升，當(dāng)溫度為25 ℃時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量達到最高值，溫度為25、27 ℃條件下，二者的產(chǎn)量差異極顯著（|t25，27|=7.21，P

3 討論

影響原生質(zhì)體制備的條件因素非常多，如木本或草本材料、對材料的預(yù)處理、pH值、酶的構(gòu)成及配比、酶解的溫度、酶解的時間、滲透壓等[9-10]，每一種條件的細微變化都會影響原生質(zhì)體的制備，使獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力不同。本研究主要從酶濃度、酶配比、時間、溫度以及滲透壓等方面設(shè)置試驗探討制備非洲紫羅蘭原生質(zhì)體的條件，最終得出一組制備其原生質(zhì)體的最適條件：即1.5%纖維素酶+0.5%果膠酶，酶解時間為3 h，甘露醇濃度為0.6 mol/L，溫度為25 ℃，在此條件下可分離出大量有活力的原生質(zhì)體。此結(jié)果為非洲紫羅蘭的基因遺傳研究、培育新品種及物種多樣性提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]陳 鑫，李 駿，余汝媛，等. 非洲紫羅蘭原生質(zhì)體的制備及不同組分培養(yǎng)基對細胞增殖的影響[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報，2012，28（5）：497-501.

[2]王 莉，姚占軍. 植物原生質(zhì)體的制備與活力檢測研究進展[J]. 生物技術(shù)通報，2009（增刊）：46-50.

[3]張曉可，於丙軍. 大豆幼苗根和葉片原生質(zhì)的分離與純化[J]. 大豆科學(xué)，2009，28（4）：697-701.

[4]楊 茹，劉世琦，張自坤，等. 大蒜原生質(zhì)體游離和純化的研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（4）：195-199.

[5]Duquenne B，Eeckhaut T，Werbrouck S，et al. Effect of enzyme concentrations on protoplast isolation and protoplast culture of Spathiphyllum and Anthurium[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2007，91（2）：165-173.

[6]羿德磊，王海朋，崔為正，等. 桑樹原生質(zhì)體分離條件的優(yōu)化試驗[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2012，38（2）：204-209.

[7]李玉珠，陶 茸，王 娟，等. 百脈根原生質(zhì)體的分離和酶解條件的研究[J]. 草地學(xué)報，2010，18（6）：798-804.

[8]蔡 肖，康向陽. 小青楊葉肉原生質(zhì)體分離條件的研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（10）：18-22.

[9]邢朝斌，沈海龍，趙星宇，等. 刺五加幼葉原生質(zhì)體的分離法[J]. 植物生理學(xué)通訊，2006，42（2）：288-290.

[10]楊光梅，杜春蕾，黃曉華，等. 辣根葉片原生質(zhì)體分離條件的研究[J]. 種子，2010，29（2）：48-51.endprint