牡丹—枝孢霉互作過程中牡丹抗氧化酶活性的變化

摘要：牡丹紅斑病是牡丹發生最為普遍的病害之一。本試驗選用抗性牡丹品種魯菏紅和易感牡丹品種趙粉作為材料，研究牡丹經枝霉菌侵染互作過程中不同抗性牡丹品種抗氧化酶活性的變化。試驗發現，魯菏紅與趙粉相比，發病較輕。二者的抗氧化酶（SOD、CAT、POD、PPO）活性變化趨勢相似，均為先升高后下降，但在不同的品種中抗氧化酶活性變化的幅度和時間不同。在魯菏紅葉內抗氧化酶活性高，處理后上升快，下降緩慢，而在趙粉中則相反。特別是POD活性，魯菏紅在48 h達到高峰，比對照上升331.2%；而趙粉在72 h達到最高，比對照升高225.5%。以上結果表明，SOD、POD、CAT和PPO活性變化大小可作為衡量牡丹對紅斑病抗性強弱的指標。

關鍵詞：牡丹；牡丹紅斑病；抗氧化酶；牡丹枝孢霉

中圖分類號： S685.110.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0228-02

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）是我國十大傳統名花之一，被譽為“花中之王”。牡丹不但欣賞價值高，還是名貴的中藥材。牡丹籽油因其營養豐富，又有醫療保健作用，被專家稱為“世界上最好的油”[1]。因此，牡丹栽培面積不斷增加。隨著栽培面積的擴大，其病害也逐年加重。據調查，國內牡丹病害有20多種[2]，其中牡丹紅斑病，也叫霉病、輪斑病，是牡丹上發生最為普遍的病害之一，由牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae Pass.）侵染引起[3]，主要危害部位為葉片。受害牡丹植株長勢衰弱，花色衰退，嚴重時甚至死亡，引起牡丹品質差、苗木產量低，造成了重大經濟損失，嚴重影響了牡丹產業的健康發展。通過調查發現牡丹不同品種間抗病性存在很大差異[3-4]，開發利用抗病品種是實現病害可持續控制的有效途徑之一。現在的研究多集中于病原菌的分離和鑒定，對于牡丹受病原菌侵染后的生理生化的變化研究較少[5-6]，而研究牡丹與病原菌互作過程中生理生化的變化，最易揭示牡丹的抗病本質。本試驗對不同抗病性的牡丹品種在牡丹-牡丹枝孢霉互作過程中的抗氧化酶活性變化進行研究，為抗病品種的選育提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料的培養及處理

本試驗選用抗性牡丹品種魯菏紅和易感品種趙粉，在2013年秋季從山東菏澤購入，栽入花盆（45 cm × 32 cm）中，埋入大田越冬。2014年3月中旬移入溫室，溫室溫度20～30 ℃。常規澆水、施肥管理，植株生長良好。

牡丹枝霉菌為筆者所在實驗室從病葉上分離并鑒定的菌種。在PDA培養基上培養，25 ℃黑暗培養10 d，待菌落直徑約6 cm時，用毛刷將病原孢子刷下，用無菌水配制成3.5×106 個/mL的孢子懸浮液。選取長勢一致的植株，采用無創傷接種，用噴霧法將菌液噴至葉片的正反面至滴水為止。參照吳玉柱等的方法[7]，微型噴霧器噴霧保濕3 d，對照用無菌水噴施。分別于接種病原菌后的0 h（處理前）、12、24、48、72、120 h 取樣，于09：00取材取牡丹枝條倒2、3葉，進行相關生理指標的測定。

1.2 生理指標的測定方法

超氧化物歧化酶（SOD）及過氧化物酶（POD）活性的測定均參照劉家堯等的方法[8]；過氧化氫酶（CAT）和多酚氧化酶（PPO）活性測定均參照郝再彬等的方法[9]。

1.3 發病情況統計方法

在病原菌處理10 d后統計牡丹發病情況，染病率=發病葉片數/調查的總葉片數×100%，以染病率來表示不同品種的抗病情況。

數據使用Excel處理，用SAS 8.1數據處理軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同牡丹品種的發病情況

趙粉、魯荷紅噴施病原菌后，均有病斑的出現，但出現的時間不同，趙粉3 d有小斑點出現，而魯荷紅5 d才開始出現小斑點。10 d后統計發病情況（表1），可知發病程度有顯著差異，趙粉的發病率為69.0%，而魯菏紅為39.2%，說明魯菏紅對紅斑病的抗性高于趙粉。

2.2 牡丹-枝孢霉互作過程中葉片SOD活性變化

SOD是在植物活性氧（ROS）清除系統中第一個發揮作用的重要抗氧化酶，能將O-2 · 歧化成H2O2和O2。從圖1看出，2個牡丹品種經病原菌侵染后SOD活性先上升后下降，變化的時間和幅度不同。魯菏紅處理后在24 h有高峰的出現，比對照提高45.1%，隨后開始下降，但仍高于對照。而趙粉在48 h達到高峰，比對照提高38.7%，之后又迅速下降。

2.3 牡丹-枝孢霉互作過程中葉片CAT活性變化

在生物體內CAT負責清除細胞內的過氧化氫，使之分解生成氧和水，防止膜脂過氧化，使細胞免遭過氧化氫的毒害。從圖2可以看出，不同品種牡丹-枝孢霉處理后，CAT活性變化一致，均在24 h到達最高峰，魯菏紅、趙粉分別上升81.7%和88.3%，隨后下降，但趙粉的下降速度比魯菏紅要快，降低了對H2O2的清除能力。

2.4 牡丹-枝孢霉互作過程中葉片POD活性變化

POD是逆境條件下的關鍵防御酶，能清除自由基，特別是在植物的抗病中發揮作用。由圖3可知，魯菏紅牡丹枝孢霉處理后，POD活性在24 h時顯著升高，在48 h時達到最大值，比對照上升331.2%；隨后緩慢下降。趙粉在72 h達到最高，比對照升高225.5%。

2.5 牡丹-枝孢霉互作過程中葉片PPO活性變化

PPO參與了木質素前體的聚合作用，與植物抗病性密切相關。從圖4可以看出，魯菏紅經病原菌處理后，PPO活性不斷升高，在120 h稍有下降；而趙粉處理后，PPO活性升高緩慢，在72 h后迅速下降。

3 討論

病原和寄主植物在相互作用的過程中，植物表現出相當大的潛力來防御外來病原物的侵襲，進而產生一系列的生理生化反應[10]，其中植物生理生化的變化一直是抗病性研究的熱點問題，但牡丹受病原菌侵染后的生理變化研究較少。本研究中無論是抗性品種魯菏紅還是感性品種趙粉，在枝孢霉菌處理后抗氧化酶活性的變化趨勢基本相似，均表現出先上升后下降的趨勢，但不同的酶類及不同品種上升到高峰的時間和幅度不同。魯菏紅中的SOD活性在24 h出現高峰，隨后下降，趙粉在48 h出現高峰，但魯菏紅中SOD活性顯著高于趙粉。對于POD活性，魯菏紅在48 h出現高峰，而趙粉在72 h有高峰的出現，活性遠高于趙粉。對于CAT和PPO活性，魯菏紅和趙粉高峰的時間相同，但魯菏紅升高的幅度大于趙粉，而趙粉活性的下降大于魯菏紅。總的來看，抗性品種魯菏紅抗氧化酶活性上升快，活性高，下降緩慢，而感病品種趙粉酶活性上升稍慢一些，上升幅度低，相對于魯菏紅下降較快。由于魯菏紅的發病率低于趙粉，這說明抗病性的強弱與酶活性的高低有密切的關系。endprint

牡丹受到柱孢菌的侵染后SOD活性也有升高再下降的趨勢[6]，接種Fusarium spp.和Rhizoctonia后，具有較強抗病性的水稻秧苗SOD活性明顯上升，高峰出現較早[11]。近年來，多項研究表明CAT參與了植物的抗病性，抗病的可能機制還不太清楚，可能在生物侵染的早期，將H2O2分解為O2，觸發苯甲酸，生成水楊酸，啟動了植物的系統抗性（systemic ac quired resistance，SAR），增強抗病性。POD酶催化合成的木質素是細胞壁的主要成分，是抵抗病原菌入侵的重要屏障[12]，木質素的含量可能與抗病性有關[15]。本試驗中，2個牡丹品種的酶活性差異非常明顯，抗性品種POD活性變化比感病品種活性高，與王鳳敏等研究大白菜感染甘藍鏈格孢的結果[13]相似。有研究發現，真菌感染后植株PPO 活性增強，與抗病密切相關[14]，且抗性品系的總酚量和PPO活性都要比敏感性品系高。

以上結果表明，牡丹-枝胞霉抗性的大小與抗氧化酶活性密切相關，SOD、POD、CAT和PPO活性變化大小均可作為衡量牡丹抗性大小指標的依據，可為培育抗病牡丹新品種提供理論指導。

參考文獻：

[1]周海梅，馬錦琦，苗春雨，等. 牡丹籽油的理化指標和脂肪酸成分分析[J]. 中國油脂，2009，34（7）：72-74.

[2]李 麗. 山東地區芍藥病害調查及主要真菌性病害的病原鑒定[D]. 泰安：山東農業大學，2014：12-14.

[3]吳玉柱，季延平，劉 慇，等. 牡丹紅斑病的研究[J]. 林業科學研究，2005，18（6）：711-716.

[4]段瑛瑜. 菏澤地區牡丹病害調查和控制技術研究[D]. 南京：南京林業大學，2008：4-9.

[5]康業斌，商鴻生，成玉梅. 牡丹病害及其固有的化學抗病物質研究進展[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2005，33（增刊1）：247-249.

[6]楊德翠，鄭國生. 柱枝孢葉斑病侵染對牡丹生理特性的影響[J]. 北方園藝，2014（1）：57-61.

[7]吳玉柱，季延平，劉 慇，等. 牡丹紅斑病發病規律的觀察[J]. 中國森林病蟲，2004，23（5）：6-10.

[8]劉家堯，劉 新. 植物生理學實驗教程[M]. 北京：高等教育出版社，2010：195-204.

[9]郝再彬，蒼 晶，徐 仲. 植物生理實驗技術[M]. 哈爾濱：哈爾濱出版社，2002：202-212.

[10]蔣選利，李振岐，康振生. 過氧化物酶與植物抗病性研究進展[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2001，29（6）：124-129.

[11]王雅平，劉伊強，施 磊，等. 小麥對赤霉病抗性不同品種的SOD活性[J]. 植物生理學報，1993，19（4）：353-358.

[12]Lewis N G，Yamamoto E. Lignin：occurrence，biogenesis and biodegradation[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1990，41：455-496.

[13]王風敏，張魯剛，劉 靜，等. 春夏大白菜黑斑病病原鑒定和抗性鑒定方法比較[J]. 植物保護學報，2007，34（6）：614-618.

[14]Thygesen P W，Dry I B，Robinson S P. Polyphenol oxidase in potato[J]. Plant Physiology，1995，109（2）：525-531.郭愛華. 非洲紫羅蘭原生質體制備條件優化[J]. 江蘇農業科學，2015，43（10）：230-232.endprint