2種組培方式草莓的擴(kuò)繁效果及光合特性

柳燕　劉刃　竺錫武

摘要：比較分析固體培養(yǎng)基組織培養(yǎng)方式與生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式下草莓組培擴(kuò)繁效果及其穴盤(pán)苗的光合特性。采用LC Pro+型便攜式光合系統(tǒng)測(cè)定2種組培方式獲得的組培穴盤(pán)苗的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（E）、葉胞間CO2濃度（Ci）。結(jié)果顯示，在個(gè)體生物量和種苗增殖系數(shù)方面，紅頰草莓快速擴(kuò)繁采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式極顯著優(yōu)于固體培養(yǎng)基組培方式；在光合速率、氣孔導(dǎo)度和呼吸效率方面，生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式的組培穴盤(pán)苗顯著優(yōu)于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)方式的組培穴盤(pán)苗；在胞間CO2濃度（Ci）方面，生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式的組培穴盤(pán)苗與固體培養(yǎng)基培養(yǎng)方式的組培穴盤(pán)苗差異不顯著。

關(guān)鍵詞：組培方式；草莓；組織培養(yǎng)；擴(kuò)繁效果；光合特性

中圖分類(lèi)號(hào)：S668.404 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0213-03

植物組織培養(yǎng)主要有利用固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)擴(kuò)繁2種方式，其中利用固體培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)是傳統(tǒng)的組培方式，在草莓組織培養(yǎng)已有較多的研究[1-5]；利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)主要指采用生物反應(yīng)器盛裝液體培養(yǎng)基通過(guò)瞬時(shí)浸沒(méi)外植體方式培養(yǎng)獲得植物組培苗（簡(jiǎn)稱(chēng)生物反應(yīng)器培養(yǎng)或反應(yīng)器培養(yǎng)），國(guó)外自20世紀(jì)80年代就已經(jīng)開(kāi)始發(fā)展[6-12]，而我國(guó)國(guó)內(nèi)起步較晚[13-15]，生物反應(yīng)器組培擴(kuò)繁草莓苗方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。固體培養(yǎng)基組織培養(yǎng)方式與生物反應(yīng)器組織培養(yǎng)方式的比較在一些種類(lèi)植物的外植體擴(kuò)繁倍數(shù)、組培苗生長(zhǎng)形態(tài)、鮮質(zhì)量等方面都進(jìn)行過(guò)研究[16-18]，但這2種組培方式培養(yǎng)的組培苗在光合特性方面有無(wú)差別國(guó)內(nèi)外很少報(bào)道；而光合特性對(duì)組培苗的存活、壯苗有重要影響，已開(kāi)始引起重視[19-20]。因此，本試驗(yàn)開(kāi)展了2種草莓組培方式組培擴(kuò)繁效果與穴盤(pán)苗光合特性的比較研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅頰草莓植株由筆者所在的實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 組培方法

（1）固體培養(yǎng)基組織培養(yǎng)法。按劉刃等的方法[5]進(jìn)行。（2）生物反應(yīng)器組織培養(yǎng)法。按開(kāi)合式間歇浸沒(méi)植物生物反應(yīng)器（浙江理工大學(xué)生物工程研究所，專(zhuān)利號(hào)為2010202088879.1）[13]操作進(jìn)行。紅頰草莓的生物反應(yīng)器培養(yǎng)主要參數(shù)設(shè)定：裝液量1 000 mL；浸沒(méi)頻率10 min/4 h；通氣量15 L/min；培養(yǎng)時(shí)間50 d；培養(yǎng)液更換頻率25 d/次；接種密度40個(gè)/L。

1.3 光合特性的測(cè)定

將通過(guò)2種培養(yǎng)方式得到的紅頰草莓組培苗經(jīng)過(guò)穴盤(pán)（50孔穴盤(pán)，52 cm×26 cm）煉苗30 d后，移至日光溫室內(nèi)對(duì)其功能葉片的光合速率進(jìn)行測(cè)定。數(shù)據(jù)測(cè)量期間，2組組培穴盤(pán)苗均移至日光溫室，基質(zhì)含水量維持在60%。光合測(cè)定條件：外界氣溫在18～25 ℃之間，分別取生物反應(yīng)器培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的紅頰草莓各5株，要求草莓組培穴盤(pán)苗具有8～10根葉柄、生長(zhǎng)旺盛、3出復(fù)葉完全展開(kāi)等特點(diǎn)。選定每株草莓第3張新生葉。

測(cè)量前將50孔組培穴盤(pán)苗移至室外，令其在自然光下適應(yīng)1 h，以促使葉片氣孔打開(kāi)，測(cè)量在隔日10：00開(kāi)始進(jìn)行。設(shè)定LC Pro+型便攜式光合系統(tǒng)（ADC，England）的測(cè)量條件為：光合有效輻射（PAR）800 μmol/（m2·s），CO2供給濃度（350±2） μmol/mol，葉室溫度（25±1） ℃，相對(duì)濕度（65±2）%。在此條件下對(duì)組培穴盤(pán)苗葉片的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（E）、胞間CO2濃度（Ci）進(jìn)行測(cè)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013、SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種組培方式下草莓組培擴(kuò)繁結(jié)果比較

在2種組培方式下培養(yǎng)的組培苗平均鮮質(zhì)量（g）和外植體增殖系數(shù)見(jiàn)表1，在生物反應(yīng)器培養(yǎng)下的外植體增殖系數(shù)可達(dá)到6.98，比對(duì)照組固體培養(yǎng)法的增殖系數(shù)（6.03）高158%，且差異極顯著；生物反應(yīng)器培養(yǎng)獲得的組培苗平均鮮質(zhì)量為4.14 g，是對(duì)照組固體培養(yǎng)（2.31 g）的1.79倍，且差異極顯著，說(shuō)明單位時(shí)間內(nèi)相同數(shù)量的草莓外植體使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)可獲得更多的種苗數(shù)量，提高擴(kuò)繁效率。從生物量和種苗增殖系數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，紅頰草莓快速擴(kuò)繁采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式極顯著優(yōu)于固體培養(yǎng)基組培方式。

2.2 2種組培方式的組培穴盤(pán)苗凈光合速率

從圖1可以看出，在培養(yǎng)后1、3、5、7 d，生物反應(yīng)器培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗的凈光合速率顯著高于傳統(tǒng)固體培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗；在培養(yǎng)后7、9 d，雖然兩者之間差異不顯著，但生物反應(yīng)器培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗的凈光合速率仍高于傳統(tǒng)固體培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗。總體來(lái)說(shuō)，2種組培方式得到的紅頰草莓苗的光合速率在移栽初期差異顯著，隨著在日光溫室中隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩者之間的差異有逐漸縮小的趨勢(shì)。

2.3 2 種組培方式下組培穴盤(pán)苗的氣孔導(dǎo)度

從圖2可以看出，通過(guò)間歇浸沒(méi)式生物反應(yīng)器得到的草莓組培穴盤(pán)苗葉片在培養(yǎng)后1 d的氣孔導(dǎo)度為

0.441 mmol/（m2·s），傳統(tǒng)固體培養(yǎng)的苗的氣孔導(dǎo)度為0.362 mmol/（m2·s），兩者之間差異顯著。培養(yǎng)后1、3、5、7 d，生物反應(yīng)器組培穴盤(pán)苗與傳統(tǒng)固體培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗的氣孔導(dǎo)度差異顯著；在培養(yǎng)后7 d，生物反應(yīng)器的組培穴盤(pán)苗在氣孔導(dǎo)度上與傳統(tǒng)固體組培穴盤(pán)苗之間差異不顯著，但整個(gè)測(cè)量過(guò)程中生物反應(yīng)器組培穴盤(pán)苗氣孔導(dǎo)度均高于傳統(tǒng)固體組培穴盤(pán)苗。

2.4 2種組培方式下組培穴盤(pán)苗的蒸騰速率

從圖3可以看出，在培養(yǎng)后1、3、5、7 d，生物反應(yīng)器組培穴盤(pán)苗的蒸騰速率均高于傳統(tǒng)固體組培穴盤(pán)苗。2種組培穴盤(pán)苗的蒸騰速率差值在培養(yǎng)后5 d達(dá)到最大，生物反應(yīng)器組培穴盤(pán)苗為5.771 mmol/（m2·s），傳統(tǒng)固體培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗為4.879 mmol/（m2·s）；在培養(yǎng)后1、3、5、7 d，生物反應(yīng)器培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗與傳統(tǒng)固體培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗的蒸騰速率差異顯著；在培養(yǎng)后7 d，生物反應(yīng)器培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗蒸騰速率與傳統(tǒng)固體培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗之間差異不顯著。endprint

2.5 2種組培方式下組培穴盤(pán)苗的胞間CO2濃度

從圖4可以看出，生物反應(yīng)器培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗的胞間CO2濃度均低于傳統(tǒng)固體培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗，在培養(yǎng)后9 d時(shí)的差值最大，生物反應(yīng)器組培穴盤(pán)苗的Ci值為313.9 μmol/mol，傳統(tǒng)固體組培穴盤(pán)苗的Ci值為323.3 μmol/mol。在培養(yǎng)后1、3、5、7、9 d，2種不同培養(yǎng)方式得到的組培穴盤(pán)苗差異均不顯著。

3 結(jié)論與討論

本研究比較分析了生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式與傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方式下紅頰草莓組培擴(kuò)繁效果及其穴盤(pán)苗的光合特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅頰草莓組培擴(kuò)繁采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式優(yōu)于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)方式。生物反應(yīng)器組培擴(kuò)繁效果優(yōu)于固體培養(yǎng)基組培擴(kuò)繁效果，在其他一些植物種類(lèi)的組培研究中已有一些報(bào)道[13-15，17]。本研究結(jié)果證明，利用生物反應(yīng)器組培擴(kuò)繁草莓也是可行的，并具有顯著優(yōu)勢(shì)。

筆者發(fā)現(xiàn)，在組培苗的光合性能方面，生物反應(yīng)器培養(yǎng)的草莓組培穴盤(pán)苗優(yōu)于傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗。生物反應(yīng)器培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和呼吸效率顯著優(yōu)于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗。結(jié)果表明，組織培養(yǎng)方法影響了苗的光合特性。本研究結(jié)果與Zhao等的結(jié)果[14，19]是相似的，即在強(qiáng)力通風(fēng)條件下的苗比對(duì)照苗有更大的凈光合速率。Zhao等發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)力通風(fēng)能增強(qiáng)葉綠素含量[14]。筆者認(rèn)為，強(qiáng)力通風(fēng)可能是生物反應(yīng)器培養(yǎng)方法培養(yǎng)的苗有更大的光合速率的原因。生物反應(yīng)器培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗的氣孔導(dǎo)度顯著大于固體培養(yǎng)基的組培穴盤(pán)苗的氣孔導(dǎo)度，這個(gè)結(jié)果與Zhao等的結(jié)果[14，21]是一致的。Majada等發(fā)現(xiàn)，葉中氣孔的功能在通風(fēng)條件下被改進(jìn)[21]；Zhao等發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)力通風(fēng)能增強(qiáng)氣孔密度[14]。生物反應(yīng)器培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗呼吸效率顯著大于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗，這個(gè)結(jié)果還沒(méi)有被報(bào)道，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。生物反應(yīng)器培養(yǎng)的組培穴盤(pán)苗的胞間CO2濃度均低于傳統(tǒng)固體組培穴盤(pán)苗，但差異不顯著，可能是因?yàn)樯锓磻?yīng)器中組培苗相對(duì)較多，密度明顯大于固體培養(yǎng)法組培瓶中組培苗密度。隨著組培穴盤(pán)苗在自然環(huán)境下生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，2種培養(yǎng)方式得到的組培穴盤(pán)苗在凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率3個(gè)方面呈現(xiàn)出差異縮小的趨勢(shì)，這可能與組培穴盤(pán)苗逐步適應(yīng)自然環(huán)境條件有關(guān)。生物反應(yīng)器培養(yǎng)的草莓穴盤(pán)苗在初期具有更好的凈光合特性，能夠更加快速地適應(yīng)外部環(huán)境，從而增加穴盤(pán)苗幼苗期的存活率，更高的凈光合速率也意味著更高的壯苗率，因此在商業(yè)化生產(chǎn)上具有較明顯的優(yōu)勢(shì)。

參考文獻(xiàn)：

[1]覃蘭英，徐光霞，鄧世秀.草莓莖尖離體培養(yǎng)大量繁殖研究初報(bào)[J]. 中國(guó)果樹(shù)，1981（3）：38-40.

[2]郭亞華，于志明，鄧立平，等. 草莓組織培養(yǎng)研究初報(bào)[J]. 生物技術(shù)，1991，1（3）：30-32.

[3]羅君琴，李 麗，林 俊，等. “紅頰”草莓莖尖快繁技術(shù)研究[J]. 現(xiàn)代園藝，2008（11）：4-5.

[4]孫永平，高年春，張 瓊，等. 紅頰草莓組培快繁技術(shù)研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（5）：63-64.

[5]劉 刃，呂 樂(lè)，竺錫武.紅頰草莓組培標(biāo)準(zhǔn)化及穴盤(pán)壯苗研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（7）：34-37.

[6]Tisserat B，Vandercook C E. Development of an automated plant culture system[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1985，5（2）：107-117.

[7]Simonton W，Robacker C，Krueger S. A programmable micropropagation apparatus using cycled liquid medium[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1991，27（2）：211-218.

[8]Lorenzo J C，González B L，Escalona M，et al. Sugarcane shoot formation in an improved temporary immersion system[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1998，54（3）：197-200.

[9]Alister B，F(xiàn)innie J，Watt M P，et al. Use of the temporary immersion bioreactor system （RITA） for production of commercial Eucalyptus clones in Mondi Forests （SA）[J]. Liquid Culture Systems forin vitro Plant Propagation，2005，4：425-442.

[10]Berthouly M，Etienne H. Temporary immersion system：a new concept for use liquid medium in mass propagation[J]. Liquid Culture Systems for in vitro Plant Propagation，2005，2：165-195.

[11]Hempfling T，Preil W. Application of a temporary immersion system in mass propagation of Phalaenopsis[J]. Liquid Culture Systems for in vitro Plant Propagation，2005，2：231-242.endprint

[12]Roels S，Escalona M，Cejas I，et al. Optimization of plantain （Musa AAB） micropropagation by temporary immersion system[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2005，82（1）：57-66.

[13]陳集雙，張本厚，賈明良，等. 間歇浸沒(méi)的開(kāi)合式植物生物反應(yīng)器：中國(guó)，2010202088879.1[P]. 2011-04-27.

[14]Zhao Y，Sun W，Wang Y，et al. Improved mass multiplication of Rhodiola crenulata shoots using temporary immersion bioreactor with forced ventilation[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，166（6）：1480-1490.

[15]趙望鋒，王力華.間歇浸沒(méi)式生物反應(yīng)器在大規(guī)模組織培養(yǎng)中的應(yīng)用研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（2）：317-320，323.

[16]Maene L，Debergh P. Liquid medium additions to established tissue cultures to improve elongation and rooting in vivo[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1985，5（1）：23-33.

[17]賈明良.三葉半夏[Pinellia ternata （Thunb.） Breit.]組培標(biāo)準(zhǔn)化研究及生物反應(yīng)器擴(kuò)繁[D]. 杭州：浙江理工大學(xué)，2010.

[18]畢瑞明.不同培養(yǎng)方法對(duì)甘薯無(wú)菌苗生長(zhǎng)的影響[J]. 生物技術(shù)，2002，12（2）：26-28.

[19]月 德，Desjardins Y，Gosselin A.草莓組培苗的光合能力與強(qiáng)制通氣對(duì)其生長(zhǎng)的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào)，1993，20（2）：123-126.

[20]王必尊，唐粉玲，何應(yīng)對(duì)，等. 不同基質(zhì)對(duì)香蕉組培苗生長(zhǎng)及光合特性的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2013，34（3）：398-402.

[21]Majada J P，Centeno M L，F(xiàn)eito I，et al. Stomatal and cuticular traits on carnation tissue culture under different ventilation conditions[J]. Plant Growth Regulation，1998，25（2）：113-121.楊燕林，王朝文，楊洪濤，等. 不同土壤條件對(duì)藍(lán)莓生長(zhǎng)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：216-217.endprint