多抗菌素發酵培養基響應面優化

楊洋　胡永紅　楊文革　曹崢　張棋

摘要：以多抗菌素生產菌Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382為試驗菌株，在單因素試驗的基礎上進行Plackett-Burman試驗和中心組合試驗設計，采用響應面法建立發酵培養基的優化模型，得到最優產多抗菌素的培養基：蔗糖17.42 g/L，酵母膏18.72 g/L，KH2PO4 0.69 g/L，FeSO4 0.2 g/L，CaCO3 0.3 g/L。經試驗驗證，在此條件下，多抗菌素的效價可達2 300 μg/mL，比優化前提高了40%。

關鍵詞：多抗菌素；培養基優化；響應面法；條件；效價

中圖分類號： S482.2+8 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0154-04

目前，植物病害在全球范圍內每年造成高達數千億美元的損失，而其中又以真菌病害最為嚴重。多抗菌素（polyoxins）也被稱為多效霉素，多抗霉素，多氧霉素，是一種抗真菌核苷類抗生素。多抗菌素能夠抑制真菌細胞壁幾丁質的合成，被廣泛應用于治療水稻紋枯病、梨黑斑病和番茄灰霉病等植物真菌病害，是一種有效防治植物真菌病害的生物農藥[1-2]。多抗菌素作為一種廣譜性抗生素，具有良好的內吸性和高度的靶標生物選擇性，已成為國內外殺菌、除蟲的一線藥物之一[3-4]。然而，在多抗菌素發酵生產過程中，多抗菌素效價低、生產成本高、發酵周期長等問題限制了其推廣應用[5-7]。因此，對多抗菌素發酵培養基優化及條件初探具有重大意義。本研究以多抗菌素生產菌Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382為試驗菌株，應用響應面法系統考察了影響多抗菌素效價的培養基成分，得到最佳培養基配方，從而提高多抗菌素的產量。

1 材料與方法

1.1 菌種

多抗菌素產生菌Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382，由課題組保藏。

1.2 培養基

斜面培養基：馬鈴薯200 g/L，蔗糖：20 g/L，瓊脂15～20 g/L，自然pH值；種子培養基：蔗糖10 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，FeSO4 0.2 g/L，CaCO3 0.3 g/L，pH值6.0；發酵培養基蔗糖20 g/L，酵母膏20 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，FeSO4 0.2 g/L，CaCO3 0.3 g/L，pH值6.0。

1.3 主要試劑和儀器

試驗主要試劑：蔗糖、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉（國藥集團化學試劑有限公司），FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O、NaNO3、CuSO4、CaCO3（廣東汕頭市西隴化工廠）。

試驗儀器設備：電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）、滅菌鍋（華粵行儀器有限公司）、醫用凈化工作臺（蘇州凈化設備廠）、鼓風電熱恒溫干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）、基礎分析型純水機（青島富勒姆科技有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 多抗菌素含量的測定 用管碟法測量發酵液中多抗菌素的含量。使用水稻紋枯菌為指示菌種，配制不同濃度的多抗菌素標品，牛津杯裝液量為200 μL，置于28 ℃培養箱中培養48 h。根據不同濃度標品和抑菌圈的大小，繪制標準曲線。

1.4.2 單因素試驗設計 分別對氮源、碳源、無機鹽進行優化，配制發酵培養基，28 ℃發酵培養5 d，測定每種因素對多抗菌素含量的影響，選擇最佳培養基成分。

1.4.3 響應面試驗設計

1.4.3.1 Plackett-Burman（PB）設計試驗 采用PB試驗從多個單因素中篩選出對多抗菌素發酵影響最顯著的幾個因素，使用Design Expert軟件設計試驗方案，包括11個變量（n=11），其中8個主要因素（蔗糖、麥芽糖、肌醇、蛋白胨、酵母膏、FeSO4、KH2PO4、CaCO3）和3個虛擬變量（表1），11個變量分別用A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K來代表，每個變量有高（+）和低（-）2個水平，設置高（+）水平是低（-）水平的1.5倍，共進行12組試驗（表2）。

1.4.3.2 最陡爬坡試驗 在PB試驗中得到了影響較為顯著的3個因素，并且根據PB設計得出的一次項擬合方程中相應變量的系數，從而確定變化梯度和爬坡方向。若變量系數為負，則該變量水平以梯度遞減的方向進行爬坡試驗。若變量系數為正，則該變量水平以梯度遞增的方向進行爬坡試驗，這樣就能夠經濟、快速地逼近最佳區域。將最陡爬坡試驗中得到的多抗菌素發酵產量最高點作為中心組合設計的的中心點來設計試驗方案。

1.4.3.3 響應面分析法 經過最陡爬坡試驗，逼近多抗菌素最大化生產區域，根據中心組合設計（central composite design）原理，對經過PB和爬坡試驗的變量進行5水平試驗（-α、-1、0、+1、+α），共20組，使用Design-Expert軟件對試驗結果進行分析，研究多抗菌素的最優發酵培養基配方。

2 結果與分析

2.1 多抗菌素含量的測定

配制不同濃度的多抗菌素標樣，使用管碟法（牛津杯法）測定不同濃度多抗菌素標準品的抑菌圈大小，以抑菌圈直徑（mm）為橫坐標、多抗菌素濃度（μg/mL）為縱坐標繪制標準曲線，見圖1。多抗菌素濃度在200～2 400 μg/mL范圍內線性擬合度良好，其回歸方程為y=138.23x-2 058.46，x代表抑菌圈直徑，y代表多抗菌素濃度。相關系數r=0.998，說明該方程具有良好的相關性，可以用于多抗菌素含量的測定。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 氮源對多抗菌素發酵的影響 氮源在合成菌體蛋白質、核酸、酶及各種初級和次級代謝產物等含氮物質的過程中發揮著重要的作用，同時在發酵生產中氮源還起著調節菌體的生長及生物量的作用。由圖2可知，有機氮源比無機氮源對多抗菌素發酵的促進作用更為顯著，在添加有機氮源的培養基中，菌體生長良好，產物正常生成；而在添加無機氮源的發酵培養基中，菌體生長較稀疏，并且無法產生多抗菌素，這可能是因為該鏈霉菌無法利用無機氮源來生產多抗菌素。在有機氮源中，酵母膏效果最好，蛋白胨次之。endprint

2.2.2 碳源對多抗菌素發酵的影響 碳源是構成菌體的基本骨架，是菌體生長的能量來源，是各種代謝產物的重要來源，通過影響菌體的呼吸、能量、生長及相關代謝最終影響抗

生素等次級代謝產物的產量。由圖3可知，在供試的8種碳源中蔗糖、麥芽糖和肌醇對多抗菌素發酵效果較為理想，其中蔗糖效果最好。其他5種碳源對多抗菌素生成的效果相對較差，該鏈霉菌對其他5種碳源利用率不高。

2.2.3 無機鹽對多抗菌素發酵的影響 在微生物生命活動中，無機鹽構成菌體組成成分，作為酶的組成部分，酶的激活劑或是抑制劑，調節培養基滲透壓、pH值及氧化還原電位等。由圖4可知，添加KH2PO4多抗菌發酵效果最好，FeSO4和CaCO3次之。因此在下個階段的PB設計中，將KH2PO4、FeSO4 和CaCO3作為考察因素，其用量分別為0.2、0.5、1 g/L。

2.3 響應面試驗設計

2.3.1 Plackett-Burman（PB）試驗 對多抗菌素發酵影響較大的8個主要因素，再加3個虛擬變量（表1）。每個變量有高（+）、低（-）2水平，共計12次試驗結果見表2。使用Design-Expert軟件對表2進行分析，結果見表3。由表3可知，上述8個因素對發酵生產多抗菌素的顯著性由大到小的順序為蔗糖、酵母膏、KH2PO4、麥芽糖、蛋白胨、肌醇、CaCO3、FeSO4，其中蔗糖為極顯著因素。該模型R2=0.975 9，表示該模型可以解釋97.59%的發酵產多抗菌素水平的變化。P值小于0.05表示該因素為顯著因素，從8個因素中選出對多抗菌素發酵生產影響顯著的因素（蔗糖、酵母膏、KH2PO4）進行下一步試驗優化。

2.3.2 最陡爬坡試驗 根據PB試驗設計結果，蔗糖、酵母膏、KH2PO4的模型方程系數為正值，其濃度水平應增加，根據3個因素的效應值大小設計它們的變化方向及步長進行最陡爬坡試驗，試驗設計結果見表4。由表4可知，選擇第5組試驗方案時，即蔗糖20 g/L、酵母膏20 g/L、KH2PO4 0.7 g/L，對應的多抗菌素發酵液效價達到最高值，以此值為中心值進行響應面試驗，這樣響應面方程更能充分地逼近真實值。

2.3.3 響應面分析法 經過Plackett-Burman試驗和爬坡試驗，確定蔗糖、酵母膏、KH2PO4的水平，利用Design-Expert 軟件設計響應面試驗（表5）。根據表6結果，使用Design-Expert軟件進行擬合，得到三元二次回歸方程y=2 021.98-160.49x1-55.76x2-77.29x3+6650x1x2-16.00x1x3+7.75x2x3-170.21x12-177.28x22-237.91x32，其中：y為多抗菌素效價，x1、x2、x3分別為蔗糖、酵母膏、KH2PO4濃度。

2.4 響應面優化結果的分析

由二元回歸方程所得到的的響應面圖與相應的等高線圖見圖5至圖7。各因素交互作用對響應值多抗菌素產量的影響由圖可以直觀地反應出來[8-10]

圖5表明，在KH2PO4一定的情況下，蔗糖和酵母膏的交互作用顯著，隨著蔗糖和酵母膏含量的增加，多抗菌素效價不斷提高，后期呈現小幅下降。

由圖6可知，在酵母膏一定的情況下，隨著蔗糖和KH2PO4含量的增加，多抗菌素效價不斷提高，后期呈現下降趨勢。在一定程度上，提高培養基中蔗糖和KH2PO4的含量有利于提高多抗菌素效價，但蔗糖濃度過高會影響細胞通透性，抑制菌體生長，不利于多抗菌素產量的增加。

由圖7可知，在蔗糖一定的情況下，酵母膏和KH2PO4交互作用較顯著，隨著酵母膏和KH2PO4含量的增加，多抗菌素效價不斷提高，但酵母膏對多抗菌素效價的影響大于KH2PO4對產量的影響。

為了能夠求出培養基的最佳配方，對回歸方程中各個變量求一階偏導數，解得：x1=17.42，x2=18.72，x3=0.69，此時多抗菌素效價為2 076 μg/mL。并進行試驗驗證，在最適發酵條件下，重復3次試驗，多抗菌素效價實測值2 300 μg/mL，與預測值基本符合，說明響應面法對多抗菌素發酵培養基優化具有較強可靠性。因此，我們得到最佳培養基配方是：蔗糖17.42 g/L，酵母膏18.72 g/L，KH2PO4 0.69 g/L。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，經Plackett-Burman試驗確定

了蔗糖，酵母膏，KH2PO4為主要影響因素，在此基礎上，進行最陡爬坡試驗，確定最佳響應面區域，然后采用中心組合試驗設計和Design Expert 軟件分析計算，得到這3種因素的添加量：蔗糖17.42 g/L，酵母膏18.72 g/L，KH2PO4 0.69 g/L。經過驗證在此發酵條件下多抗菌素效價達2 300 μg/mL。然而，此研究僅限于搖瓶發酵， 很多因素（如溶氧，通氣量等）難以有效控制，下一步可以上罐分批發酵，進一步優化驗證影響多抗菌素發酵的條件。

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